二甲双胍对2型糖尿病模型大鼠肾功能及肾组织SIRT1表达的影响

二甲双胍对2型糖尿病模型大鼠肾功能及肾组织SIRT1表达
的影响
余丹;叶山东;李业琼;胡闻
【摘要】目的观察二甲双胍(MET)对2型糖尿病(T2DM)模型大鼠肾组织沉默调
节蛋白1(SIRT1) mRNA和蛋白表达的影响,探讨MET对糖尿病肾功能损害的修复作用机制.方法 30只T2DM模型大鼠随机分为糖尿病组(T2DM组)、格列本脲组(GLY组,5 mg·kg-1·d-1)和二甲双胍组(MET组,300 mg·kg-1·d-1),同时设立正常对照组(NC组).8周后,观察各组大鼠糖化血红蛋白(HbA1c)、血糖(BG)、尿素氮(BUN)、尿白蛋白排泄和肾小球基底膜厚度(GBMT)情况;免疫组化检测肾小管SIRT1蛋白表达;real-time PCR检测肾组织 SIRT1 mRNA 表达;ELISA 检测尿SIRT1蛋白排泄.结果 8周末,MET组及GLY组BG、HbA1c、尿白蛋白/尿肌酐(UACR)、尿SIRT1/尿肌酐(USIR)和GBMT明显低于T2DM组,高于NC组
(P<0.05);MET组与GLY组BG、HbA1c和GBMT差异无统计学意义(P>0.05),但UACR明显降低(P<0.05);MET组肾组织SIRT1 mRNA和蛋白表达高于 T2DM 组,但低于 NC 组(P<0.05);MET 组肾组织SIRT1表达高于GLY组(P<0.05),尿SIRT1蛋白排泄低于GLY组(P<0.05).结论二甲双胍可增加T2DM大鼠肾组织SIRT1表达,该作用可能与其肾脏保护有关.%Aim To observe the effects of metformin (MET) on the silencing regulatory protein 1 (SIRT1) mRNA and protein expression in renal tissues of type 2 diabetic mellitus (T2DM) rats, and explore its reno-protective mechanisms. Methods Thirty model T2DM rats were randomly divided to glibenclamide in-tervention group (GLY group, 5 mg·kg-1·d-1), metformin intervention group (MET group,300 mg· kg-1· d-1) and diabetic control group (T2DM group),and 10 rats with normal glucose
tolerance were used as normal control(NC group). After 8 weeks,
HbA1c,blood glucose (BG), urea nitrogen (BUN), urinary albumin, creatinine and glomerular basement membrane thickness (GBMT) were detected. The ex-pression of SIRT1 protein in renal tissues was detected by immunohistochemistry, the expression of SIRT1 mRNA in renal tissues was detected by real-time PCR, and urinary SIRT1 protein was detected by ELISA. Results At the end of 8 weeks, the levels of BG,HbA1c,urinary albumin/urinary creatinine(UACR), urinary SIRT1/urinary creatinine (USIR) and GBMT in MET and GLY groups were significantly lower than those in T2DM group (P&amp;lt;0.05). There was no sig-nificant difference in BG, HbA1c and GBMT between MET group and GLY group (P&amp;gt;0.05). The expres-sions of SIRT1 mRNA and protein in MET group were significantly lower than those in NC group (P &amp;lt;0.05), but higher than those in T2DM group (P &amp;lt;0.05). The UACR, expression of SIRT1of renal tis-sues in MET group was higher than that in GLY group (P&amp;lt;0.05),but urinary SIRT1 protein was lower than that in GLY group (P &amp;lt;0.05). Conclusion Met-formin can increase the expressions of SIRT1 in renal tissues of T2DM rats,which may be related to its renal protection.
【期刊名称】《中国药理学通报》
【年(卷),期】2018(034)005
【总页数】5页(P615-619)
【关键词】2型糖尿病;糖尿病肾功能损害;二甲双胍;SIRT1;格列本脲;足细胞
【作者】余丹;叶山东;李业琼;胡闻
【作者单位】安徽医科大学附属省立医院内分泌科,安徽合肥 230001;安徽医科大学附属省立医院内分泌科,安徽合肥 230001;安徽医科大学附属省立医院内分泌科,安徽合肥 230001;安徽医科大学附属省立医院病理科,安徽合肥 230001
【正文语种】中文
【中图分类】R-332;R322.61;R334.1;R341;R587.1;R692;R977.15
糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease，DKD)是一种常见的糖尿病慢性微血管并发症，表现为进行性白蛋白尿，随后肾小球滤过率(glomerular filtration rate, GFR)逐渐下降，导致肾衰竭伴有足细胞损失、进行性肾小球硬化和肾小管间质性
纤维化[1]。

其发病与慢性高血糖、炎症、氧化应激、肾小球血流动力异常等有关[2]。

二甲双胍(metformin, MET)是广泛使用的一线抗糖尿病药物，近来研究显示，其可减少DKD患者的尿蛋白排泄，对糖尿病肾脏病变有一定的保护作用，但机制尚不十分明确[3]。

沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)涉及多种疾病的发病机制，包括肾脏疾病[4]。

研究显示，营养感受途径的改变，如
雷帕霉素靶蛋白敏感型复合体1(mammalian target of rapamycin complex
1,mTORC1)、腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK)、SIRT1与糖尿病肾损伤的发病机制有关[5]。

在营养过剩的条件下，mTORC1、AMPK活化和SIRT1的活化减少，可能抑制自噬，而自适应自噬可以对抗糖尿病状态下的细胞应激，保护肾实质细胞[6]。

本研究观察二甲
双胍对2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠肾组织SIRT1表达的影
响，初步探讨二甲双胍对T2DM大鼠肾脏组织的保护作用及其机制。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物清洁级8 周龄♂ SD 大鼠，体质量180～220 g，购自安徽医科大
学动物中心。

所有动物自由饮食和饮水，适应性喂养1 周后开始实验。

实验期间
湿度48%，室温控制为(19±1)℃，照明、黑暗12 h交替。

1.1.2 药物与试剂二甲双胍购自上海施贵宝公司；链脲佐菌素(streptozocin, STZ)购自Sigma公司；白蛋白放射免疫试剂盒购自天津市协和公司；肌酐、尿素氮试
剂盒购自南京建成科技公司；TRIzol、引物和PCR试剂盒购自大连TaKaRa公司；格列本脲(glibenclamide, GLY)购自天津太平洋公司；SIRT1免疫组化试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；尿SIRT1 ELISA试剂盒购自上海艾来萨生物科技
公司。

1.1.3 仪器 DG-3022A型酶联免疫检测仪(江苏南京国营华东电子管厂)；DFM-96型10管放射免疫计数仪(安徽合肥众成机电公司)；DS-5型糖化血红蛋白检测仪(英国DREW公司)；NDl000紫外/分光光度仪(美国Nano-Drop公司)；
ABI7500型扩增仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法
1.2.1 T2DM大鼠模型的建立、分组及给药 44只SD大鼠，随机分为正常组10只和模型组34只。

正常组大鼠给予普通饲料饲养，模型组大鼠给予高脂饲料(含88%常规饲料、10%猪油、2%胆固醇) 。

饲养4周后，禁食不禁水12 h，然后腹腔注射STZ(30 mg·kg-1)建立T2DM大鼠模型。

造模72 h后，大鼠禁食不禁水8 h，尾静脉采血测定血糖≥16.7 mmol·L-1为造模成功。

共30只造模成功，随机分为
糖尿病组、二甲双胍(300 mg·kg-1·d-1) 治疗组和格列本脲组(5 mg·kg-1·d-1)，
每组均为10 只，灌胃给药，每天1次，连续8 周，T2DM大鼠继续高糖高脂饲
料喂养。

1.2.2 标本的采集干预治疗8周后，用代谢笼收集12 h尿液，混匀后留取尿液5 mL，置于-40℃冰箱中，待测尿肌酐、尿SIRT1和尿白蛋白。

收集尿标本后，各组大鼠在10%的水合氯醛腹腔注射麻醉下，行腹主动脉插管采集血标本，待测血糖(blood glucose，BG)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、糖化血红蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)。

取出大鼠的双肾组织，用生理盐水反复灌洗，去除包膜，右肾部分组织放置于液氮中保存，留做real-time PCR，其余肾脏组织用来观察肾脏的病理变化。

1.3 检测指标及方法
1.3.1 生化指标的检测尿肌酐检测使用苦味酸比色法，尿SIRT1检测采用ELISA 法，血尿素氮检测使用尿酶法，尿白蛋白检测使用放射免疫分析法。

尿SIRT1及尿白蛋白排泄取其与尿肌酐的比值来表示，以排除尿液稀释的影响，表示为尿SIRT1 肌酐比(urinary SIRT1/urine creatinine，USIR)和尿白蛋白肌酐比(urinary albumin/urine creatinine, UACR)。

1.3.2 免疫组化检测肾组织SIRT1蛋白表达石蜡切片脱蜡水化；滴加3% H2O2，在室温下孵育15 min，以阻断内源性过氧化物酶；用PBS冲洗5 min×3 次；滴加10%的正常山羊血清封闭液，置于室温下20 min；滴加一抗(SIRT1稀释浓度为1 ∶200)，4℃冰箱过夜；次日用PBS洗3 min×3次；滴加二抗，放置于37℃温箱内孵育30 min，用PBS清洗3 min×3次；用DAB显色；自来水冲洗，复染后脱水至透明，封片。

每张切片选取3个视野拍照，采用全自动图像分析系统(Image Pro Plus 6.0)测定图像阳性反应部分的面积及相应的累积光密度(integral optical density , IOD)，选取各切片阳性物质的相对含量，用SIRT1IOD表示。

1.3.3 Real-time PCR法检测肾组织SIRT1 mRNA表达用TRIzol法提取肾组织RNA，提取2 μg总RNA逆转录为cDNA，产物分别进行SIRT1及β-actin的扩
增。

SIRT1引物序列为上游：5′-TGTTTCCTGTGGGATACCTGA-3′，下游：5′-TGAAGAATGGTCTTGGGTCTTT-3′；β-actin引物序列为上游：5′-GCCTTAGCCTGGACCCATAG-3′，下游：5′-GACCACCAATCCACACAGA-3′。

使用ABI7500型扩增仪，在20 μL反应体系下运用荧光染料法，95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸1 min的热循环40次；95℃15 s、60℃ 1 min及95℃ 15 s循环1次。

内参和目的片段分别同批扩增，每组同时设置3
个复孔，采用ΔΔCt法分析Ct值, 2-ΔΔCt表示目的基因mRNA表达的拷贝数与
β-actin拷贝数之比。

Tab 1 Biochemical indicators after 8 weeks of intervention in
n=10)GroupBG/mmol·L-1HbA1c/%BUN/mmol·L-1USIR/μg·g-1UACR/mg·g-
1NC4．45±1．074．13±0．896．91±2．5211．83±1．250．25±0．66T2D
M15．60±1．56∗12．41±0．61∗18．95±0．98∗28．15±2．80∗2．86±0．10∗MET11．75±0．98∗#8．78±0．32∗#11．30±2．02∗#13．76±1．11∗# 1．80±0．08∗#GLY11．78±1．43∗#8．85±1．07∗#14．03±2．55∗#△15．43±1．15∗#△2．37±0．12∗#△
*P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs T2DM group; △P<0.05 vs MET group
1.3.4 电镜观察取部分肾皮质在
2.5%戊二醛室温下固定30 min，制作成超薄切片，在10 000倍下采取10个视野，并随机选取8处，测量肾小球基底膜厚度(glomerular basement membrane thickness, GBMT)，求其平均值。

电子显微
镜下观察肾小球足细胞形态。

1.4 统计学处理运用SPSS 16.0软件进行数据分析，数据用表示，方差齐性数据
运用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行组间的比较，用SNK检验进行两两
比较，用Dunnett’s T3检验方差不具有齐性者。

2 结果
2.1 各组大鼠一般生化指标的比较 8周末，与正常组比较，各组T2DM大鼠的血HbA1c、BG、BUN、USIR、UACR水平明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；与T2DM组比较，MET组和GLY组上述指标明显降低(P<0.05)，但高于NC组(P<0.05)。

MET组与GLY组之间BG和HbA1c值差异无统计学意义(P>0.05)，BUN、USIR和UACR差异有统计学意义(P<0.05)。

见Tab 1。

2.2 各组大鼠肾组织SIRT1蛋白表达的变化 Fig 1、Tab 2免疫组化结果显示，NC 组肾组织SIRT1表达最多，其余各组SIRT1IOD水平均减少，差异有统计学意义(P<0.05)。

与T2DM组比较，MET组及GLY组SIRT1蛋白表达水平增加
(P<0.05)，MET组SIRT1蛋白表达高于GLY组，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 各组大鼠肾组织SIRT1 mRNA表达的变化 Real-time PCR结果显示，NC组
肾组织SIRT1 mRNA表达最多，其余各组SIRT1 mRNA水平均减少，且差异存
在统计学意义(P<0.05)；MET组和GLY组肾组织SIRT1 mRNA表达明显高于
T2DM组(P<0.05)，且MET组SIRT1 mRNA表达高于GLY组，差异有统计学意义(P<0.05)，见Tab 2。

Fig 1 Expression of SIRT1 in renal tissues of each group (×400)
A: NC group; B: T2DM group; C: MET group; D: GLY group
2.4 各组大鼠肾组织病理学变化 Fig 2电镜下可见，NC组肾脏结构清晰，足突无
融合，GBM厚薄均匀；T2DM组GBMT明显增厚，与NC组比较，差异有统计
学意义(P<0.05)，且足突融合，结构模糊不清；MET组和GLY组GBMT较
T2DM组明显减低(P<0.05)，足突融合明显改善；GLY组与MET组GBMT差异
无统计学意义(P>0.05)。

见Tab 2。

Tab 2 Comparison of GBMT and expression of mRNA and protein of SIRT1 after 8 weeks of intervention in rats
n=10)GroupGBMT/nmSIRT1IODSIRT1mRNANC137．96±18．5194．90±19．301．03±0．04T2DM433．52±56．50∗28．84±4．89∗0．52±0．05∗ME T255．58±27．15∗#47．86±5．97∗#0．88±0．06∗#GLY259．27±27．73∗#38．09±6．10∗#△0．69±0．04∗#△
*P<0.05 vs NC group; #P<0.05 vs T2DM group; △P<0.05 vs MET g roup
3 讨论
SIRT1是长寿蛋白(Surtuin)家族的一员[7]，是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adeninedinucleotide, NAD+)依赖性脱乙酰酶，在调节胰岛素信号和代谢率、控制胰岛素敏感性、脂肪储存代谢及葡萄糖利用等方面都起着高度保守的作用[8]。

SIRT1参与许多细胞的代谢，并涉及人类疾病(如肥胖、T2DM、癌症、神经变性疾病)的发生发展[9]。

Kume等[5]证实，在糖尿病状态下，代谢障碍可通过激活mTORC1的靶标以及减少AMPK和SIRT1活性而损害自噬作用。

下
调肾脏中SIRT1的表达可抑制自噬，导致线粒体活性氧(reactive oxygen species，ROS)的积聚，参与糖尿病肾病的发生[7]。

文献报道，SIRT1可能通过调节转录因子如p53的活性，保护肾小球足细胞[10]。

Bao等[3]证实，激活线粒体AMPK-SIRT1-过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子α(peroxisome proliferators activated receptor gamma co-activator 1α, PGC-1α)信号通路，可缓解高脂饮食所致的糖尿病模型大鼠体内氧化应激和线粒体破坏，并增加肾脏肾病蛋白和足细胞标志蛋白的表达，SIRT1激活可阻止肾细胞凋亡，抑制炎症和纤维化[7]。

Fig 2 The pathological changes in kidneys of rats after 8 weeks of intervention observed under electron microscope (×10 000)
A: NC group; B: T2DM group; C: MET group; D: GLY group
二甲双胍是一线抗糖尿病药物，Caton等[11]研究发现，二甲双胍可增加肝组织SIRT1蛋白表达和活性，抑制TORC2介导的糖异生。

本动物实验结果显示，经二甲双胍及格列本脲干预8周后，MET组和GLY组BUN、UACR和GBMT均低于
T2DM组，足细胞病理改变减轻，且MET组低于GLY组，但两组血糖和HbA1c 无明显的差异，提示二甲双胍在降血糖作用相似的情况下，其肾脏保护作用较格列本脲更具优势,部分独立于血糖的降低。

进一步观察显示，糖尿病模型组大鼠肾组
织SIRT1蛋白和mRNA表达明显降低，MET和GLY干预治疗后，可明显增加肾
组织SIRT1表达，且二甲双胍优于格列本脲。

提示二甲双胍可上调T2DM大鼠肾组织SIRT1蛋白和mRNA的表达，进而对肾脏提供一定的保护作用。

MET增加
肾组织SIRT1表达的机制尚不十分明确，可能与其抑制炎症反应、减轻氧化应激
和诱导自噬有关。

Tsuruoka等[12]发现，高血糖状态下足细胞SIRT1和PGC-1α的表达减少，导致线粒体损伤。

二甲双胍激活AMPK/SIRT1旁路，减轻氧化应激，降低NAD+/NADH比值，从而增加SIRT1活性[11,13]。

此外，二甲双胍也可直
接刺激SIRT1的表达和增加其活性，并通过调节SIRT1下游靶标叉头转录因子(Forkhead box O1，FoxO1)和p53/p21，保护内皮细胞[14]，激活SIRT1/ FoxO1通路，致线粒体氧化应激降低[15]。

Zheng等[16]报道了视网膜内皮细胞
在高血糖条件下，二甲双胍直接或部分通过肝激酶B1(liver kinase B1，LKB-
1)/AMPK通路，增加SIRT1水平/活性，从而抑制ROS产生、NF-κB的激活以及Bax诱导的细胞凋亡。

并且，二甲双胍治疗恢复SIRT1表达，可通过蛋白激酶
A(protein kinase A, PKA)独立的途径诱导自噬[17]。

本研究结果显示，二甲双胍
干预组尿SIRT1蛋白排泄明显降低，有待进一步观察。

综上所述，本实验初步结果显示二甲双胍可降低糖尿病大鼠肾组织SIRT1蛋白和mRNA的表达，该结果可能与其肾脏保护作用有关。

(致谢: 本研究在安徽医科大学附属省立医院糖尿病研究室和病理科完成，在此致以由衷的感谢! )
参考文献：
[1] Lieberthal W, Levine J S.The role of the mammalian target of rapamycin (mTOR) in renal disease[J].J Am Soc Nephrol, 2009,20(20):2493-502.
[2] Skupien J, Warram J H,Niewczas M A,et al.Synergism between circulating tumor necrosis factor receptor 2 and HbA1c in determining renal decline during 5-18 years of follow-up in patients with type 1 diabetes and proteinuria[J].Diabetes Care, 2014,37(9):2601-8.
[3] Bao L,Cai X,Dai X, et al.Grape seed proanthocyanidin extracts ameliorate podocyte injury by activating peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1α in low-dose streptozotocin-and high-carbohydrate/high-fat diet-induced diabetic rats[J].Food Funct, 2014,5(8):1872-80.
[4] Roth M, Chen W Y.Sorting out functions of sirtuins in
cancer[J].Oncogene, 2014,33(13):1609-20.
[5] Kume S, Koya D, Uzu T, et al.Role of nutrient-sensing signals in the pathogenesis of diabetic nephropathy[J].Biomed Res Int,
2014,2014(8):3154-94.
[6] Kitada M, Ogura Y, Monno I, et al.Regulating autophagy as a therapeutic target for diabetic nephropathy[J].Curr Diab Rep, 2017,17(7):53.
[7] Kitada M, Kume S, Takeda-Watanabe A, et al.Sirtuins and renal diseases: relationship with aging and diabetic nephropathy[J].Clin Sci (Lond), 2013, 124(3):153-64.
[8] Yang T, Fu M, Pestell R, Sauve A A.SIRT1 and endocrine
signaling[J].Trends Endocrinol Metab, 2006, 17(5):186-91.
[9] Moynihan K A, Grimm A A, Plueger M M, et al.Increased dosage of mammalian Sir2 in pancreatic beta cells enhances glucose-stimulated insulin secretion in mice[J].Cell Metab, 2005, 2(2):105-17.
[10] Liu R, Zhong Y, Li X, et al.Role of transcription factor acetylation in diabetic kidney disease [J].Diabetes, 2014,63(7):2440-53.
[11] Caton P W, Nayuni N K, Kieswich J, et al.Metformin suppresses hepatic gluconeogenesis through induction of SIRT1 and GCN5[J].J Endocrinol, 2010,205(1):97-106.
[12] Tsuruoka S, Hiwatashi A, Usui J, et al.The mitochondrial SIRT1-PGC-1α axis in podocyte injury[J].Kidney Int, 2012, 82:735-6.
[13] 王光宇, 毕亚光, 刘向东,等.二甲双胍对高糖培养H9c2细胞Connexin43表达的影响[J].中国药理学通报, 2016, 32(7):920-4.
[13] Wang G Y, Bi Y G, Liu X D, et al.Effects of metformin on the expression of Connexin43 in H9c2 cells cultured with high glucose [J].Chin Pharmacol Bull, 2016,32(7):920-4.
[14] Arunachalam G, Samuel S M, Marei I, et al.Metformin modulates hyperglycaemia-induced endothelial senescence and apoptosis through SIRT1[J].Br J Pharmacol, 2014,171:523-35.
[15] Tikoo K, Lodea S, Karpe P A, et al.Calorie restriction mimicking effects of roflumilast prevents diabetic nephropathy [J].Biochem Biophys Res Commun, 2014,450(4):1581-6.
[16] Zheng Z, Chen H, Li J, et al.Sirtuin 1-mediated cellular metabolic memory of high glucose via the LKB1/AMPK/ROS pathway and therapeutic
effects of metformin[J].Diabetes, 2012, 61(1):217-28.
[17] Song Y M, Lee Y H, Kim J W, et al.Metformin alleviates hepatosteatosis by restoring SIRT1-mediated autophagy induction via an AMP-activated protein kinase-independent pathway[J].Autophagy, 2015, 11(1):46-59.。