全二维气相色谱 四极杆质谱法检测植物油脂中脂肪酸

2012年11月Vol.30No.11November 2012
Chinese Journal of Chromatography
1166~1171
研究论文
DOI :10.3724/SP.J.1123.2012.06041
∗通讯联系人:潘家荣,博士,教授,研究方向为食品安全.E-mail :panjr @.基金项目:国家科技支撑计划课题(2011BAK 10B 04).收稿日期:2012-06-28
全二维气相色谱-四极杆质谱法检测植物油脂中脂肪酸
郑月明1,2,㊀冯㊀峰2,㊀国㊀伟2,㊀储晓刚2,㊀潘家荣1,3∗,㊀贾㊀玮2
(1.中国农业科学院农产品加工研究所,北京100193;2.中国检验检疫科学研究院,
北京100123;3.中国计量学院,浙江杭州310018)
摘要:建立了植物油脂中31-四极杆质谱(GC ˑGC-qMS )分析方法㊂样品经甲酯化衍生后,以DB-1柱(30m ˑ0．25ˑ25)柱(3．2m ˑ0．1mm ˑ0．1μm )作为二维柱组成柱系统进行分离,在调制周期为3．5s ㊁四极杆质量扫描范围为m /z 40~350的条件下,植物油脂中31种脂肪酸成分可以在50min 内得到准确和灵敏的检测㊂将本方法应用于实际样品的分析,灵敏度较传统的气相色谱-质谱法提高了100倍以上,㊂分析提供了新的技术手段,同时对于确保食用植物油的质量安全㊁㊂关键词:全二维气相色谱-四极杆质谱;脂肪酸;植物油
中图分类号:O 658㊀㊀㊀文献标识码:A ㊀㊀㊀文章编号:1000-8713(2012)11-1166-06
㊀㊀分是由一分子甘油和三分子脂肪酸合成的甘油三酸
酯,另外还有少许游离脂肪酸㊂研究表明,植物油中
的脂肪酸种类及含量对人体健康有重要影响[1]㊂
㊀第11期郑月明,等:全二维气相色谱-四极杆质谱法检测植物油脂中脂肪酸
由于不同种类的植物油以及同一种类但来自于不同
产地或是不同采收期的植物油所含脂肪酸种类㊁含
量也都有一定差异[2,3],因此建立植物油中脂肪酸组成和含量的分析方法,获取不同种类食用植物油
的特征脂肪酸标识物,对于确保食用植物油的质量
安全,消除食用植物油的掺假伪劣等都有重要意义㊂㊀㊀
法报道,例如气相色谱法㊁
分析中发挥了较大的作用,但是由于植物油中的脂
肪酸成分复杂,且有许多脂肪酸的含量较低,使用上
述方法可能无法对植物油中的所有脂肪酸进行准确
识别和定量㊂近年来,全二维气相色谱串联飞行时
间质谱技术(GCˑGC-TOF MS)由于其高峰容量㊁
高分离度及高灵敏度而受到广大分析工作者的重
视,其在复杂基质成分分析等领域也已经显示了明
显的优越性[7-9]㊂但采用全二维气相色谱串联四极杆质谱(GCˑGC-qMS)进行植物油中脂肪酸成分分析的研究尚未见报道㊂本研究建立了植物油中脂肪酸成分的GCˑGC-qMS定性定量分析方法,一些植物油中微量的脂肪酸成分也得到了识别㊂
1㊀实验部分
1.1㊀仪器、试剂与材料
㊀㊀QP2010Ultra GCˑGC-MS仪(日本,岛津公司)配冷喷调制器ZX1(美国Zoex公司),一维数据采集由GC-MS solution2．5软件完成,二维数据采集由GC Image R2．2完成㊂
㊀㊀37种混合脂肪酸甲酯标准品(Sigma公司);甲醇和正己烷(HPLC级,Fisher公司);13%~15%三氟化硼甲醇溶液(上海安普科学仪器有限公司);正庚烷㊁无水Na2SO4(500ħ灼烧4h,置于干燥器中备用)(天津市化学试剂一厂)㊂所用试剂除特别标注外,均为分析纯㊂0．45μm聚四氟乙烯(PTFE)膜(Waters公司)㊂
㊀㊀标准溶液配制:取500μL质量浓度为10g/L 的混合脂肪酸甲酯标准溶液用正己烷定容至5mL,作为标准储备液,密封后置于4ħ保存㊂
㊀㊀花生油㊁玉米油㊁葵花油㊁大豆毛油㊁橄榄油㊁橄榄葵花油,市售㊂
1.2㊀色谱-质谱条件
㊀㊀一维色谱柱:DB-1(30mˑ0．25mmˑ0．25μm)(REXTEK,美国);二维色谱柱:DB-Wax(3．2 mˑ0．1mmˑ0．1μm)(Agilent,美国)㊂进样口温度250ħ;恒线速度操作模式;进样量为1μL,分流比10ʒ1;程序升温:140ħ保持5min,以4．5ħ/min升温至200ħ,再以1．5ħ/min升温至240ħ保持10min;离子源温度230ħ;电离能量70 eV;检测器电压0．98kV;接口温度250ħ;质量扫描范围m/z40~350;冷气流量7L/min,热气温度370ħ;调制周期3．5s;热喷时间350ms㊂
1.3㊀脂肪酸的衍生化处理
植物油中脂肪酸的衍生参考脂肪酸检测的国家,简述如下:准确称取0．100g植物油置于100mL平底烧瓶中,加入8mL20g/L氢氧化钠-甲醇溶液,连接回流冷凝器,80ħ水浴直至油滴;7mL,继续水浴回流2min㊂将平底烧瓶取出水浴锅并冷却至室温后,准确加入10mL正庚烷并振摇2min,再加入饱和氯化钠溶液,静置分层,取适量上清液加入4g无水硫酸钠,振荡1min后静置5min,取上层清液稀释适当倍数,经0．45μm有机滤膜过滤待测㊂
2㊀结果与讨论
2.1㊀GCˑGC-MS条件优化
2.1.1㊀色谱柱的选择
㊀㊀GCˑGC-MS的色谱柱系统由2根具有不同极性的气相色谱柱通过一个冷喷调制器连接而成,这种组合使得分析物可以同时按沸点和极性两方面性质的差异获得分离,因而有效地提高了整个色谱系统的峰容量和分离度㊂同时由于冷喷调制器的冷冻聚焦作用,使得分析物的色谱峰变得尖锐,从而提高了灵敏度[11]㊂为了获得最大的峰容量和分离度,本研究对GCˑGC-MS中的色谱柱系统进行了优化,由于化合物在经过二维气相色谱柱的时间必须要小于冷喷调制器的一个工作周期,所以二维色谱柱一般选用柱长较短的极性色谱柱㊂本研究选择DB-Wax作为二维色谱柱,该色谱柱以聚乙二醇为固定相,可根据化合物的极性不同从而达到较好的分离㊂㊀㊀本研究主要选用了3种一维色谱柱进行对比分析,以确定最优柱系统㊂首先考察了与DB-Wax极性有明显差异的DB-1型非极性色谱柱和Rxi-5sil 型弱极性色谱柱(二者均为30mˑ0．25mmˑ0．25μm,REXTEK,美国)对脂肪酸成分的分离效果㊂结果表明,一维柱为Rxi-5sil时的分离效果要明显差于一维柱为DB-1时的分离效果㊂图1为C18和C20类脂肪酸在上述2个色谱柱系统上的分离谱图㊂在此基础上,又比较了DB-1型色谱柱(长度均为30m,内径0．25mm)固定相涂层的厚度对脂肪
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色谱第30卷
酸分离的影响,结果表明尽管1μm 膜厚的分离效果稍优于0．25μm 膜厚的分离效果,但柱流失严重,易干扰微量脂肪酸成分的分析,因此,本研究最
终确定的柱系统中一维柱使用0．25μm 膜厚的DB-1气相色谱柱,二维柱使用DB-Wax 型色谱柱进行油脂中脂肪酸的分析
㊂
图1㊀不同柱系统下脂肪酸甲酯的分离情况
Fig.1㊀Separation of fatty acid methyl esters by different column systems
㊀1D column :DB-1or Rxi-5sil (30m ˑ0．25mm ˑ0．25μm );2D column :DB-Wax (3．2m ˑ0．1mm ˑ0．1μm );GC temperature pro-gram :140ħfor 5min ,rise to 200ħat 4．5ħ/min ,200-240ħat 1．5ħ/min ,hold at 240ħfor 10min ;injector temperature :250ħ;ion source temperature :230ħ;MS transfer line :250ħ;electron ionization :70eV ;scan range of m /z :40-350;inject volume :1μL ;split ratio :10ʒ1;modulation period :3．5s ;hot pulse (370ħ):350ms ;liquid N 2flow :7L /min.
㊀1.C 18ʒ3n 6;2.C 18ʒ3n 3;3.C 18ʒ2n 6c ;4.C 18ʒ2n 6t ;5.C 18ʒ1n 9c ;6.C 18ʒ1n 9t ;7.C 18ʒ0;8.C 20ʒ5n 3;9.C 20ʒ4n 6;10.C 20ʒ3n 6;11.C 20ʒ3n 3;12.C 20ʒ2;13.C 20ʒ1;14.C 20ʒ0.
2.1.2㊀冷喷调制器参数优化
㊀㊀冷喷调制器是二维色谱的核心部件,其中包含冷喷气和热喷气两路气体,分析物从第一根色谱柱流出,经冷喷气低温聚焦后再由热喷气高温脱附释放到第二根色谱柱中㊂在二维色谱运行过程中,冷喷气持续释放,热气脉冲式喷射,前后两次热喷之间的时间称为调制周期(Pm ),每次热气释放的时间称为热喷时间[12]㊂
㊀㊀冷喷气的流速对于不同化合物有所不同,此处温度需低于化合物流出温度120~140ħ方可达到捕集聚焦效果,对于碳数为4~40的化合物来说,其
所需冷气量随碳数增加逐渐降低,一般为15．5~1．5L /min [13]㊂通过观察本研究中的目标分析物在不同冷气量条件下的一维色谱峰是否被切开,确定冷气量为7L /min ㊂
㊀㊀调制周期时间对目标分析物在二维色谱上的信号强度和分离情况有重要的影响,过短的调制周期
时间会导致一个化合物被分割在多个调制周期从而导致信号强度降低,另外可能使二维保留时间超过调制周期的化合物在下一个周期与下一个周期的化合物共流出;过长的调制周期会降低一维色谱的切割次数使其不足3次,降低一维色谱的分辨率㊂图2为不同调制周期下棕榈酸(C 16ʒ0)在二维色谱上的响应情况㊂由图2可以看出,调制周期为3s 时,
其信号强度为另两个调制周期(3．5s 和4s )的1/10;调制周期为3．5s 和4s 时棕榈酸的信号强度尽管在同一个数量级,但3．5s 时信号强度更高些㊂另外18碳脂肪酸在3．5s 调制周期下的分离情况较4s 时的效果好(见图3)㊂因此,本研究的调制周期最终定为3．5s ㊂
㊀㊀对于热喷时间,分别考察了250㊁300㊁350ms ,其中350ms 使得目标物在一维色谱柱上基本不拖尾,即这段时间恰好将分析物释放到二维色谱柱中,
二维进样时间刚好合适㊂
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㊀第11期
郑月明,等:全二维气相色谱-
四极杆质谱法检测植物油脂中脂肪酸
图2㊀不同调制周期时间下棕榈酸甲酯(C 16ʒ0)
在二维色谱上的色谱图
Fig.2㊀Slice profile of GC ˑGC of palmitic acid
methyl ester (C 16ʒ0)under different modulation periods (Pm )
㊀1
D column :DB-1;2
D column :DB-Wax.Other conditions as in Fig ．1.
图3㊀不同调制周期下18碳脂肪酸的二维色谱图
Fig.3㊀GC ˑGC contour plots of fatty acid chains with
18carbons under different modulation periods
㊀1D column :DB-1;2D column :DB-Wax.Other conditions as in Fig ．1.
2.1.3㊀质谱扫描质量范围的确定
㊀㊀为了对植物油中所有可能存在的脂肪酸进行识别和检测,需要采用全扫描模式进行分析㊂由于二维色谱峰非常窄,一般为0．1~0．6s ,为增加定性定量的准确度和灵敏度,需要使用尽可能高的扫描频率㊂四极杆型质谱检测器扫描的质量范围大小与扫描频率成反比,为提高扫描频率,需要选择尽量窄的质量范围㊂考虑到植物油中的脂肪酸甲酯通常含有的离子,且响应较高,为保证谱图的完整性,起始扫描质荷比需设为40;对于扫描质荷比的上限,尽管本研究使用的37种脂肪酸甲酯混合24个碳原子的脂肪酸,但植物油中的脂肪酸一般为10~22个碳原子[14],质量数在350以内,因此对于混合标准品中大于22个碳原子的脂肪酸(C 23ʒ0,C 24ʒ0,C 24ʒ1),本研究未作检测,仅选择350为扫描的最大质荷比㊂在上述质量范围内,当设定四极杆的扫描速率为20000amu /s 时,扫描频率可达33．3Hz ,此时一个二维峰包含9~12个点,保证了化合物的准确定性定量㊂
此外,根据国家标准,本研究使用的溶剂为正庚烷,如果要检测37种脂肪酸甲酯混合标准品中小于10个碳原子数的3种脂肪酸(C 4ʒ0,C 6ʒ0,C 8ʒ0),必须要降低并延长起始温度的时间,而植物油中几乎不含小于10个碳原子数的脂肪酸,因此不检测这3种脂肪酸并不影响对植物油中脂肪酸的分析㊂图4即为优化条件下剩余的31种脂肪酸甲酯混合标准品(C 10~C 22)的二维色谱图㊂
图4㊀脂肪酸甲酯混合标准品的二维色谱图
Fig.4㊀GC ˑGC contour plot of mixed fatty acid
methyl ester standards
㊀1D column :DB-1;2D column :DB-Wax.Other conditions as in Fig.1.
2.2㊀灵敏度的比较
㊀㊀为了考察GC ˑGC-qMS 相对于传统的GC-MS
的灵敏度,本研究比较了优化条件下脂肪酸甲酯在GC ˑGC-qMS 和GC-MS 上信噪比的差异㊂其中图
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色谱
第30卷
5a 为肉豆蔻酸在一维色谱上的响应情况,图5b 为肉豆蔻酸在二维色谱时的响应情况㊂肉豆蔻酸在二维色谱上被调制成3个碎片峰,其信号响应强度比一维色谱提高了20倍以上,信噪比则比一维色谱提高了100倍以上
㊂
图5㊀肉豆蔻酸甲酯(C 14ʒ0)在(a )一维色谱和
(b )二维色谱上的灵敏度
Fig.5㊀Sensitivities of myristic acid methyl ester (C 14ʒ0)
on (a )GC-MS and (b )GC ˑGC-qMS
表1㊀不同植物油样品中脂肪酸的含量
Table 1㊀Contents of fatty acids in different vegetable oils
%
Fatty acid
Bean oil Corn oil 1Corn oil 2Sunflower oil 1Sunflower oil 2
Olive
oil 1Olive oil 2Olive oil 3Olive sunflower
blend oil
C 14ʒ0(肉豆蔻酸)0.06-------0.17C 15ʒ0(十五烷酸)------
--0.07C 16ʒ0(棕榈酸)11.7013.0212.725.766.0616.8011.3410.198.10C 16ʒ1(棕榈油酸)-----1.2570.7300.587
0.20C 17ʒ0(十七烷酸)0.13-------0.14C 17ʒ1(十七烯酸)--------0.08C 18ʒ0(硬脂酸)3.991.831.965.775.672.04
3.90
3.40
9.11
C 18ʒ1n 9c (油酸)
20.0831.5630.4321.3222.1564.7075.5977.0231.49C 18ʒ1n 7c (异油酸)1.300.710.800.550.533.20
2.452.301.15C 18ʒ2n 6c (亚油酸)5
3.53
52.00
52.99
65.52
64.64
10.885.055.5346.51
C 18ʒ3n 6(γ-亚麻酸)0.070.060.09--0.05-
-
-C 18ʒ3n 3(α-亚麻酸)8.500.450.63--0.520.630.73-C 20ʒ0(花生酸)
0.350.380.370.280.280.450.310.230.82C 20ʒ1(花生烯酸)
--------0.38C 20ʒ3n 6(11,14,17-顺-二十碳三烯酸)--------0.11C 20ʒ3n 3(8,11,14-顺-二十碳三烯酸)----
-
---0.10C 22ʒ0(山芋酸)
0.27--0.350.60---1.57
Saturated fatty acid (饱和脂肪酸)16.5115.2315.0612.6212.6819.2915.5413.8219.98Monounsaturated fatty acid 21.3932.2731.2321.8622.6868.2678.7879.9133.30(单不饱和脂肪酸)Polyunsaturated fatty acid
62.11
52.5253.7265.52
64.64
11.465.686.2646.72(多不饱和脂肪酸)㊀
-:not detected.
2.3㊀定性和定量分析方法
㊀㊀本研究中31种脂肪酸的定性,主要通过将标准品二维谱图中各峰点质谱图导入NIST 谱库检索的方式而实现;对于谱图接近㊁无法识别的几种顺式/反式异构体种类,则是通过单一标准品进样的方式进行判定㊂结果表明本研究所检测的31种脂肪酸都得到了较好的分离,未发现在二维色谱上出现重组的现象㊂
㊀㊀由于本研究旨在确定不同油脂中脂肪酸组成的差异,所以无须对脂肪酸的绝对含量进行确定㊂考,其在质谱上的响应值相,因积归一化法测定脂肪酸的相对含量㊂
2.4㊀实际样品分析
㊀㊀本研究选取市场上包括大豆油㊁玉米油㊁葵花油㊁橄榄油及橄榄葵花调和油等5种植物油进行了定性定量分析(结果见表1)㊂从表1可以看出,上述植物油均以不饱和脂肪酸为主要成分,但各成分含量差异显著㊂橄榄油以油酸为主,含量高达64．70%~77．02%;大豆油㊁玉米油㊁葵花油以亚油酸
为主,含量分别为52．00%~65．52%;5种油中除葵花油㊁橄榄葵花油外均含0．5%左右的亚麻酸,其中大豆毛油的亚麻酸含量较高,为8．50%㊂文献[15]报
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㊀第11期郑月明,等:全二维气相色谱-四极杆质谱法检测植物油脂中脂肪酸
道,亚麻酸是大豆毛油的豆腥味来源之一,本研究的结果进一步证明了这一结论㊂比较脂肪酸的组成和含量可以看出,上述5种植物油中橄榄葵花油的脂肪酸组成最为复杂㊂图6即为橄榄葵花油样品脂肪酸成分的二维色谱图,在识别出的15种脂肪酸当中,除了传统方法所能检出的脂肪酸外,还检出了
8,11,14-顺-二十碳三烯酸(0．10%-顺-二十碳三烯酸(0．11%)㊁十五烷酸
酸(0．14%)㊁十七烯酸(0．08%)
图6㊀橄榄葵花调和油样品的二维色谱图
Fig.6㊀GCˑGC contour plot of olive sunflower blend oil ㊀1D column:DB-1;2D column:DB-Wax.Other conditions as in Fig．1.
3㊀结论
㊀㊀本研究建立了植物油脂中脂肪酸成分的全二维气相色谱-四极杆质谱分析方法㊂相对于传统的气相色谱-质谱法,本方法的灵敏度提升了100倍以上㊂将本方法应用于市售植物油样品的检测,不仅常规脂肪酸的检测结果与传统的方法相一致,而且一些微量的脂肪酸在部分样品中被检出㊂这表明,使用全二维气相色谱-四极杆质谱法进行食用油脂样品的脂肪酸分析检测可以有效确保检测结果的可靠性和准确度㊂该方法可望在保障食品安全过程中发挥重要作用㊂
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