自组装普鲁士蓝膜修饰丝网印刷电极构建高灵敏生物传感器

自组装普鲁士蓝膜修饰丝网印刷电极构建高灵敏生物传感器彭京蒙;储震宇;石磊;金万勤
【摘要】在丝网印刷碳电极上,采用层层自组装法制备普鲁士蓝薄膜,同时基于戊二醛交联法在薄膜上固定葡萄糖氧化酶,从而构建一种高灵敏度、低成本的葡萄糖生物传感器.考察组装温度和层数对薄膜形貌的影响.在最佳组装条件35℃和40层下,获得了均匀、连续分布的具有纳米立方颗粒结构的普鲁士蓝薄膜.普鲁士蓝立方结构有利于薄膜催化活性的提高,而戊二醛交联法可有效用于酶的固定并保持酶的活性,从而提高传感器的灵敏度和稳定性.在-0.05 V工作电位下,制备的传感器具有超高的灵敏度(111.834 mA/(mol·L-1·cm2)),宽的线性范围(0～1.2 mmol/L),低的检测极限(1μmol/L),同时具有优良的重复性、稳定性和抗干扰能力.本研究中,普鲁士蓝薄膜的制备及酶的固定简单易行,同时结合丝网印刷技术,可实现葡萄糖生物传感器的批量化制备,具有显著的应用前景.
【期刊名称】《南京工业大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2016(038)004
【总页数】7页(P39-45)
【关键词】丝网印刷电极;自组装法;普鲁士蓝;戊二醛交联法;电化学生物传感器【作者】彭京蒙;储震宇;石磊;金万勤
【作者单位】南京工业大学材料化学工程国家重点实验室,江苏南京210009;南京工业大学材料化学工程国家重点实验室,江苏南京210009;南京工业大学材料化学工程国家重点实验室,江苏南京210009;南京工业大学材料化学工程国家重点实验室,江苏南京210009
【正文语种】中文
【中图分类】O614
葡萄糖作为生物体内重要的供能物质,与人类的日常生活息息相关。

对葡萄糖的检测,在食品工业中的质量监测、化工发酵过程的控制及糖尿病病情诊断有着重要的意义[1]。

葡萄糖的传统检测方法有光学法和电化学法。

其中,电化学法中的酶电极法因具有高的灵敏度、优良的选择性和操作简便等优点受到广泛关注。

近年来,酶生物传感器的研究得到了飞速的发展。

开发具有实际应用且性能优异的酶生物传感器及其相应的制备技术,是生物传感器领域研究的重要方向[2]。

丝网印刷技术是一种新型的薄膜制备技术,该方法工艺简单,成本低廉,生产效率高,适合电极的工业生产[3],为电化学生物传感器的批量化制备提供了新的技术手段。

19世纪80年代以来,人们在基于丝网印刷电极生物传感器的研究方面已经开展了大量工作[4-5]。

丝网电极生物传感器可控的印刷形貌丰富了传感电极的种类,拓展了实际应用范围。

酶生物传感器的性能主要取决于传感薄膜的性质及酶的活性。

普鲁士蓝(PB)是一种无机铁氰配位化合物,由于其优良的电化学可逆性、稳定性及对H2O2具有特异性的电催化活性,被誉为“人工过氧化物酶”[6]。

而H2O2是酶促反应中常见的产物之一,因此,PB薄膜被广泛用于酶电化学生物传感器的构建[7]。

传统制备PB薄膜的方法主要有电沉积法及化学合成法,然而这2种方法均无法有效地用于薄膜形貌的调控,从而限制了其传感性能。

层层自组装法,因操作简便,同时可在分子尺度上精确调控薄膜结构[8-9],从而为制备高性能的PB薄膜开辟了新的研究方向。

采用层层自组装法构建的PB薄膜,可显著提高传感器的检测灵敏度,同时将测试电位降至0 V左右,增强了传感器的抗干扰能力[2]。

此外,高活性和稳定性的酶固定层有利于提高酶传感器的灵敏度和稳定性。

戊二醛交联技术利用戊二醛的不饱和基团与酶蛋白
中的自由氨基成键,从而将酶有效地固定到传感薄膜表面,并保持了酶的活性[10-11]。

因此,戊二醛交联法被广泛用于酶的固定。

本研究中,基于丝网印刷技术制备了碳电极,利用层层自组装法在碳电极上制备了PB 传感薄膜。

通过调控组装温度和层数,制备具有纳米立方颗粒结构的PB薄膜。

基于该薄膜在H2O2催化还原中的优良活性和戊二醛交联法在酶固定中的优势,制备具
有高灵敏度和稳定性的葡萄糖生物传感器。

该传感器的工作电位为-0.05 V,具有很好的抗干扰能力,可用于发酵液等复杂测试体系中葡萄糖的检测,具有巨大的实际应
用潜力。

1.1 试剂
CH-10型导电碳浆,日本 Jujo化学公司;聚酯(PET)板(厚度0.5 mm),深圳罗兰包装
材料有限公司;K4[Fe(CN)6]·3H2O、FeCl3·6H2O、葡萄糖氧化酶
(GOD,E.C.1.1.3.4,180 200 U/g),德国Sigma公司;KCl,上海化学试剂
厂;HCl(36%～38%),溧阳市东方化学试剂有限公司;戊二醛(25%水溶液),上海凌峰
化学试剂有限公司;葡萄糖、抗坏血酸(AA)、尿酸(UA)、H2O2,国药集团化学试剂
有限公司;去离子水，自制。

所用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器
碳电极由英国DEK公司生产的HORIION 03ix型自动丝网印刷机制备。

自组装过程由德国Riegler&Kirstein GmbH公司生产的DR-3型自组装膜制备装置控制。

电化学测试分析均基于上海辰华仪器有限公司的CHI660C型电化学工作站进行。

1.3 丝网印刷碳电极的制备
将导电碳浆印刷在PET基板上用于碳电极的制备。

随后,将电极置于60 ℃的烘箱
内热固化30 min,并在室温下老化1 d,最后获得丝网印刷的碳电极(长×宽=40
mm×4 mm),记为SPE。

其中,电极一端用于PB薄膜修饰,另一端用于导线连接。

1.4 自组装法制备普鲁士蓝薄膜
根据课题组前期研究成果[12],首先分别配制A和B 2种反应溶液,A:0.01 mol/L K4[Fe(CN)6]·3H2O+0.1 mol/L KCl+0.1 mol/L HCl;B:0.01 mol/L
FeCl3·6H2O+0.1 mol/L KCl+0.1 mol/L HCl。

随后,利用自组装仪器,将超声清洗10 min后的丝网印刷碳电极依次浸入溶液A中60 s、去离子水中30 s,溶液B中60 s、去离子水中30 s,该连续浸渍过程记为1次循环,如图1所示。

根据研究需求,可进行多次浸渍循环,每经过1次循环,在电极表面即组装1层PB。

组装结束后,将PB修饰碳电极置于60 ℃烘箱中处理20 min。

得到的修饰电极记为PB/SPE。

1.5 戊二醛交联法固定GOD
首先,在含有0.1 mol/L KCl的0.05 mol/L的磷酸盐缓冲溶液(PBS,pH=6.5)中加入GOD(10 mg/mL)和戊二醛(0.25%)[13]。

随后移取5 μL该混合溶液滴到PB/SPE 表面(图1),并在室温下自然干燥1 h。

制得的酶电极记为GOD/PB/SPE,置于4 ℃冰箱中储藏。

1.6 电化学测试
采用三电极测试系统,其中PB/SPE或GOD/PB/SPE为工作电极,Ag/AgCl(饱和KCl)为参比电极,Pt丝为对电极。

基于电化学工作站,采用循环伏安法、计时电流法进行电分析测试。

其中,循环伏安法的扫描范围为-0.1～0.5 V,扫描速率50 mV/s;计时电流法的操作电位为-0.05 V。

测试溶液为含0.1 mol/L KCl的0.05 mol/L PBS溶液,检测温度为室温。

2.1 PB/SPE形貌及电化学性能
2.1.1 组装温度对薄膜形貌及传感性能的影响
对于PB薄膜的生长,温度是调控其形貌的关键因素之一[14]。

在组装20层时,考察了不同组装温度(20、25、30、35和40 ℃)下制备PB/SPE的微观形貌的变化,结果如图2所示。

从图2中看到:由碳颗粒构成的SPE表面粗糙度高,具有大的比表面
积,可为PB薄膜的生长提供更多附着位点。

组装温度20 ℃时,在SPE表面生成了
非连续的PB薄膜,其由大量的立方颗粒组成,且颗粒尺寸在120 nm左右。

随着组
装温度的升高,制备的PB薄膜的连续性增强,同时立方颗粒的直径显著减小。

在35 ℃时,获得了均匀、连续分布的PB薄膜,且构成薄膜的立方颗粒的尺寸在40 nm左右。

然而,随着温度进一步升高到40 ℃,由于颗粒发生团聚,薄膜表面出现大尺寸的PB
颗粒结构,与此同时立方构型逐渐消失。

为了进一步探究组装温度对PB薄膜的影响,利用计时电流法测试了不同组装温度下制备的PB/SPE对H2O2响应情况。

由拟合的电流响应对H2O2浓度的曲线(图3)可以看到:随着组装温度的升高,灵敏度先上升后下降,并在35 ℃达到最高值。

测试
结果表明,PB薄膜的最佳组装温度为35 ℃,此时所制备的薄膜电催化活性最高。

这是因为,35 ℃下制备的连续均匀的PB薄膜组成颗粒的尺寸小,提高了薄膜的比表面积。

同时,立方构型的颗粒能提供更多的催化活性位点,从而提升了H2O2电催化还原的效率,最终显著增强了其灵敏度。

因此,组装温度35 ℃是本文中筛选的PB薄膜最佳制备温度。

2.1.2 组装层数对薄膜形貌及传感性能的影响
除了组装温度外,组装层数对PB薄膜结构也具有重要的影响[15]。

因此,在35 ℃的组装温度下,考察了组装20、30、40和50层的PB/SPE的薄膜形貌变化,结果如
图4所示。

从图4可以看到:在组装40层以内,随着层数的增加,薄膜表面的颗粒密度明显提高,而颗粒粒径变化不大。

然而,当组装50层时,薄膜厚度进一步增加,表面生成的PB颗粒发生显著的团聚,导致尺寸增大。

同时,通过循环伏安(CV)法研究了不同组装层数下制备的PB/SPE的电化学性质,结
果见图5。

由图5可见:相较SPE电极,制备的PB/SPE均具有1对氧化还原峰,该峰的出现源于PB与其还原态普鲁士白(PW)间的相互转化。

此外,在组装40层以内,
同侧峰电流的绝对值随着组装层数的增加而升高,而组装50层时,峰电流的增加不
明显。

但随着组装层数的增加,峰电流对应的电位差随之增加,50层时的差值最为显著,表明过厚的PB膜层严重阻碍了电子的界面传递。

基于不同组装层数下制备的PB/SPE,对H2O2进行了检测,结果如图6所示。

由图
6可见:组装40层以内,灵敏度随组装层数的增加而显著提高,主要是因为组装层数
增加,生成充当电子传递媒介的PB纳米颗粒增多,在H2O2还原中提供更多的催化
位点。

然而,当组装50层时,灵敏度则下降,主要原因是,PB颗粒的团聚造成薄膜有
效面积的降低,同时组装层数的增加,导致电子传输阻力增加,从而降低了电子传递效率。

基于以上探究,在组装温度35 ℃下,组装40层时,所制备的PB/SPE性能最好,适宜
于葡萄糖传感器的构建。

2.2 GOD/PB/SPE的性能
2.2.1 灵敏度、线性范围、检测极限和响应时间
在PB/SPE上固定GOD后,以葡萄糖为分析物对电极进行性能评价。

利用计时电流法,连续向检测溶液中滴加0.1 mmol/L葡萄糖溶液,获得所制备传感器的电流响应
曲线(图7)。

对葡萄糖浓度(c)和相应的响应电流密度(I)作校正曲线(见插图A),得到
线性回归方程为I=10.5+111.8c,r2=0.999 6,传感器的灵敏度为111.834
mA/(mol·L-1·cm2),线性范围为0～1.2 mmol/L,检测限为1 μmol/L。

由图7中放大插图B可见:该传感器对葡萄糖的响应时间短,约为2 s,表明所制备的传感器催化
反应速率快、电子传递速率高,能使催化反应中产生的电子迅速通过PB膜层传输到碳电极表面,进而形成响应电流。

同时,与其他基于PB的葡萄糖传感器的性能进行
比较,结果见表1。

由表1可以发现:本研究中所构建的葡萄糖传感器在检测极限和
检测灵敏度方面均具有明显的优势,这主要是由于自组装方法制备的PB膜具有均匀、连续的纳米立方结构,能够更好地发挥PB的电催化性能。

2.2.2 重复性和稳定性
从同一批制备的GOD/PB/SPE中随机选取10支电极,并将它们用于葡萄糖的测试分析,结果如图8所示。

由图8可见:灵敏度测定结果的相对标准偏差仅为3.6%,表明所制备的生物传感器个体差异性小,具有优异的重复性。

这一结果也再次证明,本研究中采用的丝网印刷和自组装技术,不仅可用于批量化传感器的制备,同时可获得精确、可靠的测试性能。

此外,将制备的GOD/PB/SPE置于4 ℃冰箱中保存,每5 d取出用于葡萄糖检测,其响应灵敏度在30 d后仍能保留最初的85.2%(图9),表明该生物传感器具有较好的稳定性。

究其原因,戊二醛交联法利用戊二醛的不饱和基团与酶的自由氨基成键,保持了酶活性的同时,使酶得到有效的固定。

2.2.3 抗干扰能力
在对真实测试体系中葡萄糖含量进行分析时,往往会受到样品中其他电化学活性物质,如AA和UA的干扰[16]。

这里,通过研究GOD/PB/SPE对该2种物质的响应来评价所构建传感器的抗干扰能力[17]。

如图10所示,注入葡萄糖后再注入相同浓度的AA和UA,几乎没有引起明显的响应电流变化,表明此传感器有优异的抗干扰能力。

这是由于PB的存在,可使该传感器在较低的检测电位(-0.05 V)下工作,从而有效地避免了这2种物质的信号干扰。

1)基于丝网印刷碳电极,本文制备一种低成本、高性能的葡萄糖生物传感器。

采用层层自组装法在碳电极上制备了均匀、连续分布的具有纳米立方颗粒结构的普鲁士蓝薄膜,可显著提高薄膜的催化活性。

戊二醛交联法有利于葡萄糖氧化酶在薄膜上高效固定,还能有效保持酶的活性,从而提高传感器的稳定性。

2)基于这些优点,该传感器在葡萄糖的检测中,表现了超高的灵敏度(111.834
mA/(mol·L-1·cm2)),宽的线性范围(0～1.2 mmol/L),低的检测极限(1 μmol/L),同时具有优良的重复性、稳定性和抗干扰能力。

该葡萄糖生物传感器,制备过程简便易行,制备成本可控,同时结合丝网印刷技术,可实现批量化制备,因此具有显著的应用
前景。

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