酶工程复习提纲资料

酶⼯程复习提纲资料
酶⼯程复习提纲
第⼆章酶的定义、组成、特征及分类
⼀、从化化学本质上讲酶到底是⼀种什么物质？
⼆、⼀般催化剂的特性：
1.只能进⾏热⼒学上允许进⾏的反应；
2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，⽽不改变反应的平衡点；
3.通过降低活化能加快化学反应速度。

4.它本⾝的数量和化学性质在化学反应后不发⽣改变。

三、酶作为催化剂的显著特点：⾼效、专⼀、温和、可调节
四、酶的分类
(⼀)、酶的组成分类
单纯酶:它们的组成为单⼀的蛋⽩质。

结合酶（全酶）:蛋⽩质（酶蛋⽩）+辅因⼦
酶蛋⽩决定反应的特异性，辅因⼦决定反应的类型与性质。

辅因⼦：
辅酶：与酶蛋⽩结合疏松，可⽤透析或超滤的⽅法除去的辅因⼦。

辅基：与酶蛋⽩结合紧密，不能可⽤透析或超滤的⽅法除去的辅因⼦。

(⼆)、酶的结构分类
(1)、单体酶(monomeric enzyme) :仅具有三级结构的酶，即只由⼀条肽链组成的酶。

(2)、寡聚酶(oligomeric enzyme)：两个或两个以上的相同或不同亚基以共价键⽅式连接⽽形成的酶。

(3)、多酶复合体(多酶体系，multienzyme system):由⼏种功能不同的酶聚合在⼀起，分⼯合作。

共同催化⼀个⽣化反应过程。

(4)、多功能酶(multifunctional enzyme)：⼀些多酶体系在进化的过程中由于基因融合，致使多种不同催化功能存在于⼀条多肽链上，这种⼀条肽链具有多种催化功能的酶叫多功能酶。

（三）、酶的功能组成—酶的活性中⼼
酶的活性中⼼：与底物结合并进⾏催化反应的特殊的必需基团。

结合基团：决定酶的专⼀性
活性中⼼内的必需基团
必需基团：催化基团：决定酶的催化性质
活性中⼼外的必需基团：维持酶的空间结构和催化功能所必需的基团
五、酶的专⼀性;
第三章酶的作⽤机理
⼀、酶作⽤专⼀性的机制
(⼀)“三点结合”的催化理论
三点结合”的催化理论认为酶与底物的结合处⾄少有三个点，只有当三点完全结合的情况下。

催化作⽤才能实现，酶促反应才能进⾏。

（⼆）锁钥学说
锁钥学说认为整个酶分⼦的天然构象是具有刚性结构的，酶表⾯具有特定的形状。

酶与底物的结合如同⼀把钥匙对⼀把锁⼀样，那把钥匙开那把锁。

也就是说，只有当底物的形状与酶的活性中⼼的构象完全匹配时，酶与底物才能结合，催化反应才能进⾏。

(三)诱导嵌合学说(Induced fit model）
酶活性中⼼的结构有⼀定的灵活性，当底物（激活剂或抑制剂）与酶分⼦结合时，在底物的诱导下，酶蛋⽩的构象发⽣了有利于与底物结合的变化，使反应所需的催化基团和结合基团正确地排列和定向，这样酶与底物才能很好地结合，酶促反应才得以进⾏。

⼆、酶⾼效催化的机制
(⼀)、酶为什么能催化化学反应
１、分⼦发⽣化学反应的必要条件：活化能和能障
在化学反应体系中，并不是所有的分⼦都能参加化学反应，只有那些所含能量达到或超过⼀定限度（平均能量）的分⼦才能参与反应。

这些能参与反应的分⼦称为活化分⼦，由常态分⼦转变为活化分⼦所需的能量称为活化能。

活化分⼦含有的能参与化学反应的最低限度的能量称为化学反应的能阈或能障。

因此，只有那些所含能量⼤于能障的分⼦才能参与化学反应。

在⼀个化学反应体系中，活化分⼦越多，反应就越快。

所以，设法增加活化分⼦数，就能加速化学反应。

２、增加活化能（活化分⼦）的途径
增加活化分⼦有两种可能的途径：⼀是加热或光照射增加能量，使⼀部分分⼦获得能量⽽活化，直接增加活化分⼦数⽬，以加速化学反应的进⾏。

另⼀种途径是降低活化能的阈值，间接增加活化分⼦数⽬。

催化剂的作⽤就是降低反应的活化能。

酶是如何降低化学反应的活化能的呢？
（⼆）、有关酶⾼效率机理的假说
1、中间产物学说
中间产物学说是⽬前较公认的解释酶作⽤机理的理论。

这个理论认为：在酶促反应中，底物先与酶结合，形成不稳定的中间产物—ES复合物，然后再分解释放出酶与产物。

ES的形成，改变了原来反应的途径。

酶的活性中⼼与底物分⼦通过短程⾮共价键(如氢键,离⼦键和疏⽔键等)的作⽤，形成ES复合物，使底物的价键状态发⽣形变或极化，从⽽激活底物分⼦和降低过渡态活化能，使底物的活化能⼤⼤降低，结果使反应加速。

2.趋近效应(approximation)和定向效应(orientation)
通常底物浓度与化学反应速度成正⽐。

若在反应系统的某⼀局部区域，底物浓度增⾼，则反应速度也随之提⾼。

趋近效应指由于活性中⼼的⽴体结构和相关基团的诱导和定向作⽤，使底物分⼦中参与反应的基团相互接近，底物在酶活性中⼼的有效浓度⼤⼤增加，并被严格定向定位，从⽽降低了进⼊过渡态所需的活化能。

使酶促反应具有⾼效率。

酶的活性中⼼部位，⼀般都含有多个起催化作⽤的基团，这些基团在空间有特殊的排列和取向，可以对底物价键的形变和极化及调整底物基团的位置等起到协同作⽤，从⽽使底物达到最佳反应状态。

3、张⼒作⽤(distortion or strain)
底物的结合可诱导酶分⼦构象发⽣变化，⽐底物⼤得多的酶分⼦的三、四级结构的变化，也可对底物产⽣张⼒作⽤，使底物扭曲，促进ES进⼊活性状态。

4、酸碱催化(acid-base catalysis)
酸和碱是有机反应中⽤途最⼴和最普遍的催化剂。

酸-碱催化可分为狭义的酸-碱催化和⼴义的酸-碱催化。

酶参与的酸-碱催化反应⼀般都是⼴义的酸－碱催化⽅式。

⼴义酸－碱催化是指通过质⼦酸提供部分质⼦,或是通过质⼦碱接受部分质⼦的作⽤，达到降低反应活化能的过程。

酶的活性中⼼具有某些氨基酸残基的R基团，这些基团往往是良好的质⼦供体或受体，在⽔溶液中这些⼴义的酸性基团或⼴义
的碱性基团对许多化学反应是有⼒的催化剂。

如氨基、羧基、巯基、酚羟基及咪唑基等。

影响酸碱催化反应速度的因素有两个：
第⼀个因素是酸碱的强度。

第⼆个因素是这些功能基供出质⼦或接受质⼦的速度。

共价催化：
催化剂通过与底物形成反应活性很⾼的共价过渡产物，使反应活化能降低，从⽽提⾼反应速度的过程，称为共价催化。

某些酶与底物结合形成⼀个反应活性很⾼的共价中间产物，这个中间产物以较⼤的机率，转变为过渡态，因此反应的活化能⼤⼤降低，底物可以越过较低的能障⽽形成产物。

5、共价催化作⽤可分为亲核催化作⽤和亲电⼦催化作⽤两⼤类。

①亲核催化作⽤：亲核催化是指具有⼀个⾮共⽤电⼦对的基团或原⼦，攻击缺少电⼦具有部分正电性的原⼦，并利⽤⾮共⽤电⼦对形成共价键催化反应。

酶分⼦中具有催化功能的亲核基团主要是：组氨酸的咪唑基、丝氨酸的羟基、半胱氨酸的巯基。

此外，许多辅酶也具有亲核中⼼。

酶中参与共价催化的基团主要包括His 的咪唑基，Cys 的硫基，Asp 的羧基，Ser 的羟基等。

②亲电⼦催化作⽤：在亲电⼦催化作⽤中，催化剂和底物的作⽤与亲核催化相反，就是说，亲电⼦催化剂缺少电⼦，从底物中吸取⼀个电⼦对形成共价键催化反应。

酶分⼦亲电⼦的基团有亲核碱基被质⼦化的共轭酸，如—NH3+。

在酶的亲电⼦催化过程中，有时其必需的亲电⼦物质不是上述的共轭酸，⽽是由酶中⾮蛋⽩组成的辅因⼦提供，其中⾦属阳离⼦是很重要的⼀类。

6、⾦属离⼦催化作⽤
（1）、提⾼⽔的亲核性能：⾦属离⼦可以和⽔分⼦的OH-结合，使⽔显⽰出更⼤的亲核催化性能。

（2）、电荷屏蔽作⽤
（3）、电⼦传递中间体
第四章影响酶促反应速度的因素
⼀、底物浓度对酶反应速度的影响（⼀）、单底物反应 1、⽶⽒⽅程
底物浓度较低时，增加底物浓度可加快酶促反应速度。

当底物饱和时，酶促反应速度不会再随底物浓度的增加⽽加快。

底物浓度与酶促反应速度的关系通常⽤⽶⽒⽅程来表⽰：
[S]K [S]
V v m m ax +=
2、⽶⽒常数的定义
⽶⽒常数是酶促反应速度达到最⼤反应速度的⼀半时的底物浓度。

Km 是⼀个物理常数。

⽶⽒常数的单位是mM 。

3、⽶⽒常数的意义
（1）K m
是酶的⼀个特征性常数，只与酶的性质有关，与酶的浓度⽆关。

（2）如酶能催化⼏种不同的底物，对每种底物都有⼀个特定的K m 值，其中K m 值最⼩
的称该酶的最适底物。

（3）K m
除了与底物类别有关，还与pH 、温度有关。

（4）K m 表⽰酶和底物的亲和⼒。

K m 越⼤，表⽰和底物的亲和⼒越⼩。

判断代谢反应
的⽅向、途径和限速步骤等。

⼆、酶的抑制作⽤和抑制作⽤动⼒学（⼀）、什么是抑制作⽤（inhibition ）?
某些物质使酶活⼒下降的作⽤叫抑制作⽤，这些使酶活⼒下降的物质，称为抑制剂（Inhibitor, I ) （⼆）、抑制作⽤的种类
1、不可逆抑制（irreversible inhibition ）：抑制剂与酶的必需基团以共价键结合，不能⽤稀释或透析去除抑制剂使得酶活⼒恢复。

2、可逆抑制作⽤(reversible inhibition)及其动⼒学（1）竞争性抑制作⽤（competitive inhibition ）①定义：抑制剂与底物竞争酶的活性结合部位
②竞争性抑制作⽤的特点：Km 增加、Vmax 不变（2）⾮竞争性抑制作⽤（noncompetitive inhibition ）①定义： I 与S 同时结合到酶的不同部位上
②特点：Km不变、Vmax降低
（3）反竞争性抑制作⽤（uncompetitive inhibition）
①定义：只有酶和底物结合之后，抑制剂才与酶和底物的复合物结合。

②特点：Km降低、Vmax降低
（三）⼀些重要的抑制剂及其实际意义
①有机磷化合物：有机磷化合物能抑制某些蛋⽩酶及酯酶的活⼒，特别是强烈抑制胆碱酯酶。

②巯基酶抑制剂：A、烷化剂：B、有机汞、有机砷化合物
③重⾦属抑制剂：Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等⾦属盐能使⼤多数酶失活。

第五章核酶和抗体酶
⼀、核酶的发现
1982年Cech等发现四膜⾍细胞⼤核期间26SrRNA前体具有⾃我剪接功能，并于1986年证明其内含⼦L-19IVS具有多种催化功能。

1995年Cuenoud等发现有些DNA分⼦亦具有催化活性。

称之为脱氧核酶。

⼆、核酶作⽤的特点
1、化学本质：RNA
2、底物：RNA
3、反应特异性(专⼀性）碱基
4、催化效率低
5、核酶是⼀种⾦属依赖酶。

⾦属离⼦起以下的作⽤：
（1）、特异的结构作⽤，或参与活性部位的化学过程
（2）、促进RNA的总体折叠
（3）、⼆价⾦属离⼦（如Mg 2+ ）与底物活性部位直接相互作⽤，参与过渡中间复合物的形成
三、核酶的应⽤
1、核酶抗肝炎病毒的研究
⽬前⼈们已进⾏了核酶抗甲型肝炎病毒（HA V)、⼄型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）以及HDV作⽤的研究。

⼈⼯设计核酶多为锤头状结构，少部分是采⽤发夹状核酶。

2、抗⼈类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV- Ⅰ)。

核酶免疫源性低，很少引起免疫反应。

1998年，美国加利福尼亚⼤学Wong-Staal等利⽤发夹核酶抑制HIV- Ⅰ基因表达，并率先进⼊临床Ⅰ期。

3、抗肿瘤治疗核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的mRNA,抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的⽬的。

4、抑制疾病基因的表达和基因治疗
通过识别特定位点⽽抑制⽬标基因的表达，抑制效率⾼，专⼀性强。

针对锤头核酶⽽⾔，催化结构域⼩，既可作为转基因表达产物，也可以直接以⼈⼯合成的寡核苷酸形式在体内转运。

5、在其他领域的应⽤
防治动、植物病毒侵害：马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶构建，马铃薯卷叶病毒复制酶基因负链的突变核酶的克隆等。

四、核酶技术⾯临的问题
1、核酶催化切割反应的可逆性问题，定向反应
2、催化效率较低，设法提⾼催化效率
3、寻找合适载体将核酶⾼效、特异地导⼊靶细胞
4、使核酶在细胞内有调控地⾼效表达
5、增强核酶在细胞内的稳定性
6、对宿主的损伤问题有待进⼀步考察
五、抗体酶（abzyme）
（⼀）、抗体酶的定义：
抗体酶或催化抗体（Catalytic antibody)是指具有酶催化活性的抗体。

是⼀种新型⼈⼯酶制剂，是⼀种具有催化功能的抗体分⼦，在其可变区赋予了酶的属性。

它是利⽤现代⽣物学与化学的理论与技术交叉研究的成果，是抗体的⾼度选择性和酶的⾼效催化能⼒巧妙结合的产物。

抗体：与抗原特异结合的免疫球蛋⽩。

抗体酶：指具有催化功能的抗体分⼦，在抗体分⼦的可变区（即肽链的N端）是识别抗原的活性区域，这部分区域被赋予了酶的属性。

（⼆）、抗体酶的催化特征
1、抗体酶的特点（与天然酶相⽐）：
（1）能催化⼀些天然酶不能催化的反应
（2）有更强的专⼀性和稳定性
（3）催化作⽤机制不同
2、抗体酶和⾮催化性抗体作⽤的⽐较
（1）更⾼的反应特异性
（2）反应的可逆性
（3）反应的量效性
（4）反应过程
（三）、抗体酶的催化作⽤机理
1、过渡态理论与抗体酶
2、抗体酶催化的三种重要反应机制
⽔解作⽤机制
基团转移
连续反应机制
3、抗体酶催化反应的介质效应
酯解反应中介质效应：抗体酶在有机溶剂中具稳定性。

脱羧反应中介质效应；有机溶剂引起脱羧反应速率增加。

酰基转移反应中介质效应：在疏⽔溶剂中，活性较⾼。

（四）、抗体酶的制备
1、细胞融合法：
2、抗体结合位点化学修饰法：对抗体酶进⾏结构修饰的关键是找到⼀种温和的⽅法在抗体结合位置或附近引⼊具有催化功能的基团。

游离巯基就是适合的基团之⼀，它具有⾼亲核性，易于氧化，及能通过⼆硫化物进⾏交换反应或亲电反应⽽选择性修饰的特点。

3、引⼊辅助因⼦法：将此半抗原通过共价键连接在载体蛋⽩免疫动物产⽣的抗体，在⾦属离⼦复合物作为辅因⼦的参与下，这些抗体酶能选择性⽔解⽢氨酸和丙氨酸之间的肽键.
4、⽤⽣物⼯程的⽅法产⽣抗体：将编码具有抗体酶活性的Fab⽚断的基因是通过细菌的形式表达出来的。

5、拷贝法：⽤酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进⾏单克隆化，获得单克隆的抗抗体。

对抗抗体进⾏筛选，获得具有原来酶活性的抗体酶。

6、共价抗原免疫法：这是在亲和标记抑制剂基础上发展起来的新的抗体酶制备⽅法。

以亲和标记剂为半抗原，则抗体结合部位将产⽣与亲和基团电荷性质相反的基团，如亲核性，亲电性氨基酸，酸性氨基酸，碱性氨基酸等。

第六章酶的分离纯化
⼀、沉淀分离：
1、沉淀剂的类型
⼆、层析分离
（⼀）离⼦交换层析
1、如何根据酶的特性选择离⼦交换介质？
2、如何根据离⼦交换介质的特性选择缓冲体系？
（⼆）凝胶层析操作（装柱、洗涤及洗脱）过程中要注意那些问题？
（三）亲和层析的原理及操作要点
第七章固定化酶
⼀、什么是固定化酶？
通过化学⽅法将⽔溶性酶与不溶性载体铰链⽽形成的不溶性酶称为固定化酶。

与天然酶⽐较，固定化酶具有可多次重复使⽤、可以装塔连续反应、纯化简单、能提⾼产物质量、应⽤范围⼴等多种优点。

⼆．固定化酶的优缺点
优点：
可多次重复使⽤
可以装塔连续反应
纯化简单
提⾼产物质量
应⽤范围⼴
缺点：
⾸次投⼊成本⾼
⼤分⼦底物较困难
三、影响固定化酶性质的因素
1．酶本⾝的变化：
主要是由于活性中⼼的氨基酸残基、⾼级结构和电荷状态等发⽣了变化。

2．载体的影响
（1）分配效应
（2）空间障碍效应
（3）扩散限制效应
3. 固定化⽅法的影响
四、固定化后酶性质的变化
1．固定化对酶活性的影响：酶活性下降，反应速度下降。

原因：酶结构的变化空间位阻2．固定化对酶稳定性的影响
（1）操作稳定性提⾼
（2）贮存稳定性⽐游离酶⼤多数提⾼。

(3 ) 对热稳定性，⼤多数升⾼，有些反⽽降低。

(4 ) 对分解酶的稳定性提⾼。

（5）对变性剂的耐受⼒升⾼
固定化后酶稳定性提⾼的原因：
a. 固定化后酶分⼦与载体多点连接。

b. 酶活⼒的释放是缓慢的。

c. 抑制⾃降解，提⾼了酶稳定性。

3、⽶⽒常数Km的变化，Km值随载体性质变化
（1）载体与底物带相同电荷，Km’>Km固定化酶降低了酶的亲和⼒。

（2）载体与底物电荷相反，静电作⽤，Km'
五、固定化酶的制备
（⼀）、各类固定化⽅法的特点⽐较:
（⼆）选择⽅法依据：
（1）酶的性质
（2）载体的性质
（3）制备⽅法的选择
（三）选择载体的原则
（1）要有巨⼤的⽐表⾯积
（2）要有活泼的表⾯
（3）便于装柱进⾏连续反应
（四）载体活化的⽅法
A．重氮法
B．叠氮法
C．烷基化反应法
D．硅烷化法
E．溴化氰法
（五）、固定化后酶的考察项⽬：
（1）测定固定化酶的活⼒，以确定固定化过程的活⼒回收率。

（2）考察固定化酶稳定性
（2）考察固定化酶最适反应条件
第⼋章化学酶⼯程
第⼀节酶分⼦的化学修饰
⼀、酶化学修饰的定义
⽤化学试剂对酶的侧链基团进⾏共价改造，从⽽赋予酶分⼦以特殊功能和提⾼酶的活⼒的⽅法，称为酶的化学修饰。

⼆．酶的化学修饰原因
1．稳定性不够，不能适应⼤量⽣产的需要。

2．作⽤的最适条件不符。

3．酶的主要动⼒学性质的不适应。

4．临床应⽤的特殊要求。

三、酶化学修饰的⽬的
1、改变活性部位的构象。

酶蛋⽩的主链经蛋⽩酶的⽔解作⽤，去掉部分肽段或者取代蛋⽩质⼀级结构上某些氨基酸残基，使活性部位的结构发⽣改变，以达到⼈们所需要的各种⽬的。

2、提⾼⽣物活性。

酶分⼦侧链基团的化学转变，改变基团的电化学性质、分⼦内基团的相互作⽤⼒等，某些情况下能提⾼酶的⽣物活性。

3、增强酶的稳定性。

⼀般酶反应条件基本接近中性，但在⼯业应⽤上，由于⽣产条件、底物等带来的影响，作⽤的pH常常不在中性；⽣产温度的提⾼，酶往往易变性失活。

这些都直接影响酶作⽤的发挥。

⽤双功能试剂让酶分⼦基团之间、内部侧链基团之间进⾏交联，可以达到提⾼酶的稳定性的⽬的。

4、降低酶类药物的抗原性。

酶是蛋⽩质，作为药物使⽤时，这些异源蛋⽩进⼊⼈体后可能成为抗原，诱导相应的抗体产⽣，这些酶类药物就会通过抗原抗体反应被清除掉，从⽽不能发挥药效，有的甚⾄还会产⽣过敏反应。

通过对酶的化学修饰，可以降低酶类药物的抗原性。

5、改变酶学性质。

利⽤有机⼩分⼦或⼤分⼦物质对活性部位或活性部位之外的侧链基团进⾏化学修饰，达到改变酶学性质的⽬的。

四、酶化学修饰的基本原理
1．如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性
2．如何保护酶活性部位与抗抑制剂
3．如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋⽩⽔解酶
4．如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
因此，在酶的化学修饰过程中需要注意以下⼏个⽅⾯：
（1）、充分了解被修饰酶。

开始设计酶化学修饰反应时，对被修饰酶的活性部位、稳定条件、侧链基团性质及酶反应的最适条件等应尽可能全⾯了解。

（2）、修饰剂的选择
选择修饰剂时要求修饰剂具有较⼤的相对分⼦质量，对蛋⽩质的吸附有良好的⽣物相容性和⽔溶性，修饰剂分⼦表⾯有较多的活性基团，还要考虑修饰剂上的反应基团的活化⽅式和活化条件，以及修饰后酶活性的半衰期。

（3）修饰反应条件的选择
修饰反应⼀般要选择在酶稳定的条件下进⾏，尽可能少破坏酶的必需基团，选择酶与修饰剂的结合率和酶活回收率都较⾼的反应条件。

对反应体系中酶与修饰剂的分⼦⽐例、反应温度、pH、时间、溶剂性质和离⼦强度等在确定反应条件时也必须考虑。

五、酶修饰⽅法
（⼀）、酶分⼦侧链基团的化学修饰
（⼆）、酶分⼦表⾯的化学修饰
（三）、蛋⽩质类及其他对酶的化学修饰。

六、修饰酶的性质及特点
1．热稳定性提⾼
修饰剂与酶多点交联，固定了酶的分⼦构象，增强酶天然构象的稳定性减少了酶热失活，增强了酶的热稳定性。

2．抗原性降低
当酶被修饰以后，酶分⼦表⾯上许多抗原决定簇在反应过程中被修饰剂结合，在空间结构上使这些抗原决定簇被屏蔽，从⽽降低了酶分⼦的抗原性或抗原抗体的结合能⼒。

3．体内半衰期延长
经过化学修饰后，由于增强了抗蛋⽩⽔解酶、抗抑制剂和抗失活因⼦的能⼒以及对热稳定性的提⾼，所以其半衰期都⽐天然酶长。

4．最适pH变化
修饰酶的微环境更为稳定。

5．酶的动⼒学性质的改变
A、⽶⽒常数Km增⼤：交联于酶上的⼤分⼦修饰剂造成空间障碍，影响了底物对酶的接近和结合，使⽶⽒常数Km增⼤。

B、修饰酶抵抗各种失活因⼦的能⼒增强。

C、体内半衰期的延长
6．对组织的分布能⼒变化
第⼆节模拟酶
⼀．模拟酶概述
（⼀）、模拟酶的概念：⽤合成⾼分⼦来模拟酶的结构、特性、作⽤原理以及酶在⽣物体内的化学反应过程，它研究吸收酶中起主导作⽤的因素，利⽤有机化学、⽣物化学等⽅法设计和合成⼀些较天然酶简单的⾮蛋⽩质分⼦或蛋⽩质分⼦，以这些分⼦作为模型来模拟酶对其作⽤底物的结合和催化过程，也就是说，模拟酶是在分⼦⽔平上模拟酶活性部位的形状、⼤⼩及其微环境等结构特征，以及酶的作⽤机理和⽴体化学等特性。

模拟酶⼜称⼈⼯酶或酶模型，它是⽣物有机化学的⼀个分⽀。

（⼆）、模拟酶的研究⽬的：研究模拟酶主要是为了解决酶容易受多种物理、化学因素的影响⽽失活，所以不能⽤酶⼴泛取代⼯业催化剂等缺点。

⼆、模拟酶的理论基础和策略
（⼀）酶学基础
酶的催化机制： Pauling的稳定过渡态理论
(⼆)超分⼦化学基础
主-客体化学：主体和客体在结合部位的空间及电⼦排列的互补
三、模拟酶的分类
四、模拟酶的制备
第九章⽣物酶⼯程
第⼀节酶基因的克隆和表达
⼀、酶基因的克隆
1、获得⽬的基因（target gene）
（1）已知序列的⽬的基因的获取⽅法：
①同源克隆法（PCR）
②⼈⼯化学合成
（2）．已知探针的基因的获取⽅法
①构建基因组DNA⽂库
②构建cDNA⽂库
（3）．未知序列的基因的获取⽅法
①随机引物PCR
②差别显⽰PCR
③代表性差式分析PCR
2、选择载体
⑴基因克隆载体的定义
基因克隆载体是指可承载外源基因并将其带⼊受体细胞且得以稳定维持的DNA分⼦。

⑵理想克隆载体的的条件
①分⼦⼩（ 10 Kb），以容纳较⼤的外源DNA。

②有克隆位点（外源DNA插⼊点）即多个单⼀酶切位点；
③是⼀个独⽴的复制⼦，有复制起始序列，可在宿主细胞中独⽴⾃主复制；
④有⾜够的copy数
⑤带筛选的标志：具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；
⑥克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因。

（3）常⽤的克隆载体（vector）
质粒（plasmid：柯斯质粒和酵母质粒）
λ噬菌体（phage）
病毒（virus）
⼈⼯染⾊体
3、⽬的基因与载体的重组
（1）⽬的基因酶切/修饰
限制性核酸内切酶：⼀类能识别双链DNA分⼦中特异核苷酸序列的DNA⽔解酶
（2）载体酶切
（3）DNA连接酶连接⽬的基因和载体
①⽤T4或E．coli DNA连接酶可连接具互补黏性末端的DNA⽚段；
②⽤T4 DNA连接酶连接具平末端的DNA⽚段；
③先在DNA⽚段末端加⼈⼯接头，使其形成黏性末端，然后再⾏连接。

④常⽤的 DNA ligase：T4 DNA ligase
只以双链DNA为底物，不能有核苷酸的缺失
只催化3’端带有羟基的断点与5’带有磷酸基的断点的连接
既可连接粘性末端，⼜可连接平末端（是⽬前已知的唯⼀的可以连
接平末端的DNA连接酶）
最适pH：7.2 - 7.8
需要ATP参加反应
4、重组载体的转化
感受态细胞的制备
0-4℃ 0.1mol/L CaCl2 冰浴15-30min
重组载体直接引⼊感受态细胞
①重组DNA导⼊原核细胞
常⽤转化或转导，先制备细菌感受态细胞，然后⽤重组DNA分⼦转化感受态细胞，并培养筛选转化⼦
②重组DNA导⼊真核细胞
常见的是导⼊酵母细胞，⼀般⽤蜗⽜酶去除酵母细胞壁形成原⽣质体，再⽤CaCl2和聚⼄⼆醇处理，重组DNA以转化⽅式导⼊酵母细胞原⽣质体，将其置于再⽣培养基上培养，使原⽣质体再⽣出细胞壁形成完整酵母细胞。

导⼊哺乳动物细胞较简便的是电穿孔法和微量注射法。

体积⼤的动物细胞可⽤微量注射法将外源DNA注⼊细胞，如受精卵。

5、重组⼦的筛选与鉴定
①根据重组载体的表型
抗药性（Ampr 、Tetr）
营养条件（⾃养、异养）
其他marker（ -互补筛选）
②根据DNA限制性内切酶的酶谱分析
③利⽤核酸杂交和放射⾃显影进⾏鉴定：原位杂交、Southern印迹
④PCR法
⑤DNA序列测定
⑥免疫学法
⼆、克隆基因的表达
表达体系的建⽴
表达载体的构建
受体细胞的建⽴
表达产物的分离纯化
(⼀)外源基因在原核细胞中的表达
⽬前应⽤最⼴的是⼤肠杆菌表达系统。

下⾯以⼤肠杆菌为例，讲述原核⽣物基因表达系统。

1．原核⽣物基因表达系统的特点
原核⽣物基因表达系统的特点如下：
①只有⼀种RNA聚合酶(真核细胞有三种)识别原核细胞的启动⼦；
②表达是以操纵⼦为单位的；
③转录与翻译偶联，是连续进⾏的；
④⼀般不含有内含⼦(intron)，缺少真核细胞转录后加⼯系统，故当含有内含⼦的真核基因在原核细胞中转录成mRNA前体后，其中内含⼦部分不能被切除；
⑤原核⽣物基因的控制主要在转录⽔平，包括起始控制(启动⼦控制)和终⽌控制(衰减
⼦控制)；
⑥在⼤肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有真核基因缺乏的转译起始密码⼦及SD序列。

2. 真核表达体系酵母、昆⾍、乳类动物细胞
优点：可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA
可适当修饰表达的蛋⽩质
表达产物分区域积累
缺点：操作技术难、费时、经济
⽅法：磷酸钙转染
DEAE葡聚糖介导转染
电穿孔
脂质体转染
显微注射
第⼆节酶分⼦的改造
⼀、概述
1、为什麽要改造酶分⼦？
多数天然酶在⼯业⽣产的条件下，难以具备商业价值的酶学特性，对天然酶进⾏分⼦⽔平的改造，以获得⽐天然酶活⼒更⾼或催化能⼒更强的新的⾮天然酶或改造天然酶。

2、酶分⼦改造的内容
主要两⽅⾯：理性设计和⾮理性设计
（1）理性设计
在研究天然酶及其突变体时，通常先获得酶分⼦特征、空间结构以及结构与功能的关系等⽅⾯信息，这些⽤各种⽣物化学、光谱学、晶体学等⽅法来解决，然后根据这些信息进⾏酶分⼦的改造，这就是酶分⼦的理性设计，它包括化学修饰、定点突变等。

（2）⾮理性设计：不需准确知道酶蛋⽩结构与功能等信息，直接通过随机突变、筛选等⽅法进⾏酶分⼦的改造，称为酶分⼦。