大肠杆菌培养实验报告

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篇一：大肠杆菌实验报告
大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选
0740063阿噟兰
1.前言
抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。

但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。

在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。

当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。

如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。

DnA对紫外线（uV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。

紫外线引起DnA结构变化的形式有DnA链断裂、碱基破坏、
胸腺嘧啶二聚体等。

因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。

一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265nm。

选择合适的诱变剂量
对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。

在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。

本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。

若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。

紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。

因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。

在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。

2.材料和方法
2.1实验材料、仪器和试剂菌种：大肠杆菌
仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器
试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水2.2实验方法2.2.1制备培养基普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）：
牛肉膏5g蛋白胨10gnacl5g琼脂20g蒸馏水
1000mlph7.0
按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml
筛选培养基(200ml)：含抗生素50mg/L。

（卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，能结合细菌核糖体的30s亚基上的
16srRnA，阻断细菌蛋白质的合成。

）
牛肉膏5g蛋白胨10gnacl5g琼脂20g蒸馏水
1000mlph7.0硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）0.2ml，按配
方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115℃15min灭菌，取出
培养基后冷却至60℃时将硫酸卡那霉素0.2ml加入培养基中，充分震荡混匀，倒平板，2皿*15ml*5组+2皿*15ml=12皿
*15ml=180ml2.2.2制备菌悬液（106~108个/mL）
①固体培养：大肠杆菌划线或涂布接种于固体培养基，37℃培养24-48h。

②菌悬液：用适量生理盐水刮洗菌落，倒入一个无菌小三角瓶（或试管）中，充分振荡使菌
体散开，得到菌悬液。

③菌悬液浓度用血球计数板计数
使用细菌计数板或血球计数板在显微镜下直接计数。

将菌液滴在血球计数板0．1ml的计数格中，细菌被固定染色后，在显微镜下选择数出若干个小格中的细菌数目，（一般数125个小格），根据比例关系折算出单位体积菌液中细菌的数量。

血球计数板规格：计数格=4*4=16大格1大格=5*5=25小格
小格体积=0.05*0.05*0.1=0.00025mm3=2.5*10-7ml(长*宽*高)
计算方法例如：125格中90个细菌，则（90÷125）÷（2.5*10-7）个/ml=2.88*106所以，125格中的细菌大约在31(4格1个菌)—3125（每个小格25个菌）个。

2.2.3诱变处理及接种
①将紫外灯打开，预热30min；
②取无菌培养皿（Φ90mm，含无菌大针），加入稀释好的菌悬液8ml以覆盖培养
皿底面为宜。

③将待处理的培养皿置于诱变箱内的磁力搅拌仪上，开启磁力搅拌仪旋纽进行搅
拌1分钟，然后打开皿盖，分别处理10s、20s、40s、80s、160s（可以累积照射），照射完毕后先盖上皿盖，再关闭搅拌和紫外灯；
④每个照射剂量分别取0.5ml分别稀释1000倍和100倍，然后取稀释液0.1ml
做普通培养基的涂布培养，每个处理两个重复；同时每个照射剂量取0.1ml照射液直接做两个筛选培养基的涂布培养。

⑤对照涂布培养：将照射的菌液稀释1000倍，在稀释液中取0.1ml做2个普通培
养基涂布培养，2个筛选培养基的涂布培养。

涂布要均匀，培养基表面无液流。

⑥37℃培养24h后，计数，统计分析。

对于筛选的抗性菌种进行验证、纯化。

2.2.4.结果计数、分析、统计及讨论
①以辐射时间为横坐标，以存活菌落数的lg值为纵坐标，作紫外线对大肠杆菌致死效应曲线。

②列公式计算不同辐射剂量下的致死率。

死亡率?
照射前活菌数/ml?照射后活菌数/ml
?100%
照射前活菌数/ml
③计算并比较不同辐射剂量下大肠管杆菌的抗药突变率，并分析不同辐射剂量的诱变效果差异原因
突变率=筛选平板菌数/普通平板菌数*100%④抗药性菌株的筛选与纯化
将一抗性克隆划线到一新的抗性平板上，与对照菌相比
较，观察生长状况
3.结果与分析
3.1实验结果记录及初步整理
表1.大肠杆菌诱变初始数据
照射时间
010*********
筛选培养基活菌数
个/皿
1号2号平均00000000000
00000000000
00000000000
普通培养下稀释度
10010-210-310-210-310-210-310-210-310-210-3
普通培养基中菌数
个/皿
1号2号平均500020003662522054000
56001820251640500000
5300182025144.51302.52000
溶液浓度个
/ml5.3*1071.8*1062.5*1064.5*1041*1043.5*10302.5*103 2*10500
3.2最佳照射时间的设置
结合数据处理结果的图和表分析，在10s的照射下，细菌死亡率达到了95%，20s时达到了99.9%，说明在20s内大部分菌株已经死亡，而整个实验过程中未发生任何正突变，可能与此有较大关系。

已经有实验证实，当菌种死亡率达到70%~80%时，突变率最大。

所以在做进一步的实验中应该减少照射剂量，或通过增多10s内的照射设置，或增大照射距离，因为时间太短可能导致控制实验的难度加大。

使死亡率变化曲线能突显出变化趋势。

3.3筛选培养基选择
筛选培养基是将发生突变的菌株从普通菌株中显现出
来并对其浓缩。

该实验中的筛选培养基中的添加剂是硫酸卡那霉素，若发生突变的菌株能对其显现出抗性，但这抗性也是有一定范围的，若超过其抗性范围即使发生突变也不能正常生长。

本实验选用的50mg/L,实验证明该浓度对于该菌种抗性选育来说已经过高，应该选择较低的浓度。

可以在试验前对该菌种的最低致死浓度做检测。

将制备好的出发菌株溶液涂布在含不同浓度硫酸卡那霉素的平板上,37℃培养24h,观察不同平板上的菌落数,并记录不同抗生素作用浓度。

凡是在前一个低浓度平板上已长出菌落而在后一个较高浓度
平板上未长出菌落的,后一浓度即为某种抗生素对出发菌株的最低致死浓度【1】。

表2.不同照射剂量下的存活率lg值和死亡率照射时间/s010*********
存活菌浓度5.3*1072.5*1064.5*1043.5*1032.5*1030 存活菌的lg值7.726.404.653.543.39
死亡菌浓度0
5.05*1075.29*1075.299*1075.299*1075.3*107
致死率00.9530.9990.99990.99991
4.小结与讨论
（1）本实验通过对大肠杆菌进行紫外线照射，欲得到抗性菌株，但由于照射剂量过大和抗生素浓度过高等原因未得到任何一株抗性菌株。

（2）通过本实验，得到了在28cm，下大肠杆菌的照射致死致死曲线，可以依此曲线反回归在该照射条件下选择合适的照射时间得到较高的突变率。

（3）欲得到较高的抗性突变率，还可尝试改变培养温度，有实验证实不同的温度培养会对细菌的突变率造成影响【2】。

（4）欲得到较好的突变率还需要较优质的菌株。

因为菌株的突变主要是发生在遗传物质复制转录的过程中，所以菌株的生理活性对突变效率会有很大影响，最好选择在对数期的菌株。

状况比较同步、易变异、重复性较好；同时为了保证处理时具有一定的细胞浓度,以增加可变异细胞总数,故选用对数期的细胞进行处理。

[1]涂国全,刘姝,黎循航.通过获得链霉菌抗性基因突
变株筛选梅岭霉素高产菌株[J].中国抗生
素,20XX,27(6):321-325.
[2]汪志芸抗生素产生菌Ap19-1的鉴定及uV诱变育种的研究[D],浙江：浙江大学生命科学学院，20XX，29 篇二：大肠杆菌生长曲线实验报告
一、实验方案设计
二、实验报告
三.实验总结
篇三：大肠杆菌实验总结
分离
划线分离：方法简单，但单菌落较难分开。

涂布分离：单菌落更易分开，但操作复杂。

（一）制备Lb培养基（通用的细菌培养基）
1、配方：蛋白胨10.0克，牛肉膏5.0g，氯化钠10.0克，水1000ml
（配固体培养基再加琼脂20克）
2、流程
计算称量
倒平板
溶解调ph分装加塞，包扎灭菌
培养基配制(特)
培养基应现配现用，每次配置350ml，一次性使用完毕。

1、按下表称取物资配置Lb培养基到500ml锥形瓶中：
2、用双层铝箔和棉绳对锥形瓶进行封口，摇晃锥形瓶以使各物质迅速、均匀、完全、
溶解。

待灭菌。

①分装：注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，因此在将培养基转移到三角瓶或试管中时必须用____。

②加塞：试管用塑料盖或__棉花塞___；三角瓶口用_封口膜__或_6层纱布封口,再用__牛皮纸__或报纸封口。

③包扎：用_牛皮纸__或报纸
④灭菌：高压蒸气灭菌法1）加水：向外层锅内加入适量的水，加水的要求是不触及内胆_.
2）装锅：物品放置的要求__：加盖：将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的_排气槽__内。

再以__两两对称方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。

3）加热排气：打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。

待冷空气完全排尽后，关上排气阀。

4）保温保压：当锅内压力升到1_kg/cm2时，控制热源，维持压力至。

5）出锅：切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力降至_0_时，打开_排气阀__，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。

否则会因锅内压力较高，打开气阀后造成的压力差可能使容器内的培养基喷溅造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至使容器爆炸。

灭菌后，通常将实验用具放入60℃~80℃_烘箱中烘干，以除去灭菌时的水分，避免引起_污染_。

⑤倒平板、制斜面操作平台：超净台
灭菌好的培养基和实验器具置于超净台上打开__紫外
线_和_过滤风，灭菌30min.
倒平板：待培养基冷却至__℃时，将每只培养皿倒入
__ml未凝固的固体培养基，置于_水平_位置上，轻轻晃动使其均匀铺满平皿底部，待凝，使之形成平面。

_倒置_备用。

制斜面：将未凝固的固体培养基的试管斜放，冷却待凝使即成为斜面。

思考题：
一、操作过程中避免带入杂菌的方法有哪些？
1、灭菌后的培养基、器具置于超净台上，并打开超净台的紫外灯和过滤风，灭菌30分钟。

2、用镊子夹出洒精棉球擦拭桌面和实验者双手。

3、整个操作在酒精灯火焰旁进行
4、打开后或加塞前试管口、三角瓶口灼烧灭菌。

二、培养基灭菌后，需要冷却到60后才倒平板，你用什么办法来估计培养基的温度呢？
可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。

三、为何要将平板倒置？
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落培养基，造成污染。

四、在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。

五、如何检查培养基是否受杂菌的污染？
将未接种的培养基放在恒温箱中培养，若无菌落产生则未受杂菌污染。

（重点）液体培养基接种培养
主要器具：接种环、摇床等
操作方法：先将接种环(:大肠杆菌培养实验报告)进行灼烧_灭菌,_冷却_后的接种环挑取少量菌种，放入三角瓶的液体培养基中，加塞。

置于_37___℃摇床振荡培养１２小时。

思考：如何冷却接种环？
可通过接触试管内壁或未长菌的培养基达到冷却的目的。

1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧
接种环？
操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存
在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到单个菌落。

2、在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
划线结束后灼烧接种环，及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。

3.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
以免接种环温度太高，杀死菌种。

4.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。

5、如何判断接种操作是否符合无菌要求？
如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求。

（五）斜面接种及菌种保存
主要器具：接种环、恒温箱、冰箱
操作过程：在无菌操作下，用接种环挑取_单__菌落，再用划线法（自斜面底部向上轻轻划直线）接种在__斜面___上，℃恒温培养箱中培养_24___小时后，__℃冰箱保存。

无菌操作：同前
思考：菌种保存为何采用斜面而不是平板？
试管斜面培养基密闭效果比平面的好很多,不容易进入杂菌，同时能用来做纯细菌的长期保存。