共聚焦激光扫描荧光显微镜

激发波长
464nm 507nm 507nm 420/480nm 494nm
发射波长
526nm 530nm 535nm 637nm 520nm
Kd 390nM 190nM 550nM 140nM 20,000nM
KCL诱导的细胞外Ca++内流测量
培养/分离的细胞 20M Fluo 3-AM负载液30-60min 清洗、换液 扫描
激发光(EXCITATION)：
能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的 光线称为该荧光素的激发光。激发/吸收光谱；吸 收波峰(最大吸收波长)
488nm 520nm
发射光(EMISSION): 发射光谱；发射波峰(最大发射波长)
异硫氰酸荧光素(FITC)
荧光探针：
能产生荧光的特异性生物染料（PI, Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物（荧光抗体）
武汉大学医学院结构生物学研究中心
Centre for Structural Biology Wuhan University School of Medicine
共聚焦激光扫描荧光显微镜
— 基本原理、应用及样本制备原则
宋健
什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜？
共聚焦激光扫描荧光显微镜（Confocal Laser Scanning
II.荧光能量共振转移的条件
488nm 520nm
540nm 650nm
1.供体与受体间的距离 <10nm或=1-7nm
2.供体的发射光谱与受体的吸收光谱 有实质性的重叠
供体荧光素 (Cy2)
受体荧光素 (Cy3)
供体荧光素 受体荧光素
488nm 520nm
650nm
供体荧光素 (Cy2)
受体荧光素 (Cy3)
激光穿透性强，可对样本进行一定深 度光学断层，获得高标准的连续光学切片
实现三维重建
三维胶原基 质培养的血 管平滑肌细 胞
共聚焦激光扫描荧光显微镜应用领域
只要目的结构是用荧光探针标记的，都可 用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察。
形态学研究：细胞凋亡、中枢神经系的F联 系、肿瘤细胞分类……
分子生物学：原位杂交，DNA、RNA定量， DNA损伤修复、外源性基因在真核细胞的表达、 定位，荧光能量共振转移大分子构象的改变 、受体与配体相互作用……
Antivibration table 防震台
共聚焦装置
X/Y扫描 装置
荧光显微镜 物镜
光电倍增管 检测 针孔 光源 针孔
步进聚焦电机
Bio-Rad LaserSharp
系统操作，图像处理 3-D重建
光源针孔 光源
聚集平面
光电倍增管 检测针孔
分色镜
物镜 样本
共聚焦扫描显微镜光学原理
检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一 点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进 入检测针孔 高分辨率的光学切片
自发荧光(AUTOFLUORESCENCE):
组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光—自发荧光。 伊文斯蓝、硼化氢钠处理
漂白(BLEACH)：
荧光物质受激发时，其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失 — 漂白。
荧光显微镜
二、荧光显微镜术的基本原理
高 压 汞
灯
滤镜 分光
紫外 蓝 绿
激发
被荧光 探针染 色的生 物样本
活细胞动态荧光测量：细胞内Ca++、K+、H+ 等离子的动态分布及动态定量、荧光漂白恢复 细胞连接间的信息沟通……
直接对活组织或整体胚胎观察：单光子共 聚焦激光扫描系统的局限性：荧光漂白
1. 荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after photobleaching; FRAP) 检测细胞连接间的信息传递
△ 厚样本：大盖玻片
Spacers
Cover slip
Slide with spacers
三维胶原基 质培养的血 管平滑肌细 胞
Intensity
Before bleach
After bleach
90 min after bleach
2 . 荧 光 能 量 共 振 转 移 ( Fluorescence Resonance Energy Transfer)
I.荧光能量共振转移: 受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递，
使后者被激发，这一过程称荧光能量共振转移。能量的提供者叫供体荧光 素，能量的接受者叫受体荧光素。
Ca2+
Aequoren + 肠腔素
蓝色荧光
GFP
绿色荧光
GFP, CFP, BFP, YFP商品化质粒
1. 转基因动物: Green mouse
2. 外源基因的报告基因: 将外源基因与GFP DNA 相连, 可实时监 测外源基因的表达.
3. 检测细胞能否表达某一基因: 将待测基因的启动子与GFP DNA 相连, 可实时监测细胞能否表达兴趣基因.
核复染
Propedium Iodide (PI) / DAPI
双标 三标
FITC/Cy2+TEXAS RED FITC/Cy2+RHODAMINE/Cy3 (必须顺序扫描)
FITC/Cy2 + TEXAS RED + Cy5.5 FITC/Cy2 + RHODAMINE/Cy3 + Cy5.5 (必须顺序扫
Fluorescence Microscope；LSFM）
以激光作为激发光源，采用光源针孔与检测针孔共轭
聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的 荧光显微镜系统
共聚焦系统 细胞CT
荧光和荧光显微镜
一、荧光的基础术语
荧光物质：
某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发 出波长比照射光长的光线 — 荧光。受激发后能 产生荧光的物质称荧光物质或荧光素
III. 常用荧光共振转移探针对
FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP
检测 以供体的激发波长的光照射样品,没有共
振转移时，只检测到供体的荧光，发生共振 转移时，供体的荧光减弱，受体被激发出现 荧光。
应用 受体与配体的相互作用：亚基的结合
与分离 大分子构象的改变
Fluorescence Intensity
4. GFP-蛋白融合技术: 将结构蛋白基因与GFP DNA 相连可实时监 测结构蛋白的表达亚细胞结构的形成
4. 活细胞内离子动态变化测量
细胞内游离Ca2+测量
原理: 检测游离Ca2+变化的荧光探针多为Ca2+螯合剂，通常不能透过细 胞膜，只有与乙酰甲酯(AM)相连方可进入细胞内, 被细胞内酯酶水解后 方能与胞内游离钙结合后发出荧光。
若须快速测量
1.改变扫描速度 2.采用双向扫描 3.减少采样点数(牺牲空间分辨率）
4.采用线扫描(xt) KCL
KCL
双光子激光扫描荧光显微系统
488nm
520nm
FITC
• 照射光波长大于荧光 染料吸收峰波长2倍
• 高能量(2KW)、超短 脉冲(兆分之一秒)聚焦, 使聚焦点瞬间产生高密 度光子, 出现双光子吸收 激发荧光
450nm
m
FITC
共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置
Confocal scan and detector unit 共聚焦扫描及检测装置
Computer
计算机
Microscope 荧光显微镜
Laser and electronic Control Unit
激光光源及 控制装置
Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System
Texas Red
Cy5 Cy5.5
EMISSION
INTENSITY [arb. units]
400 450 500 550 600 650 700 750 800
WAVELENGTH [nm]
2. 荧光探针的选择
原则：尽量减小不同荧光物质间激发/发射光谱的重叠。
标记要求 单标
荧光素选择/组合
无特殊限制。 FITC, Cy2最佳；尽量不选择Cy5, Cy5.5（红外) 与自发荧光冲突时，采用Texas Red 。
• 双光子吸收仅发生在
聚焦点, 避免了焦点外激
976nm
发而产生的漂白现象
•高能量、超短脉冲聚焦 、穿透性更强
50 m
500 m
共聚焦激光扫描荧光显微镜术样本制备的基本原则
1.常用荧光素的特性
EXCITATION and EMISSION SPECTRA
EXCITATION
Cy2 FITC
Cy3 Rhodamine
Ligand
Cy5 Cy3
Time
3. 绿色荧光蛋白（GFP）
GFP的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发 光蛋白 (aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水 母整体提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋
白即绿色荧光蛋白（ green fluorescent protein GFP）。
2.是否需要切片？ △ 激发光的穿透力：50um (单光子) - 500um (双光子) △ 荧光探针对组织的渗透能力 用震荡切片机切40-100m厚片
3.透明 酒精脱水 二甲苯透明 二甲苯+少量中性树胶湿封
4.封片：
△ 防止样本变形
△ 防止荧光褪色：封片剂：1）用PH8.5-9 PBS配制90%甘油，加苯二胺到 2mM -7mM ，调节 pH 不低于 8.5。2）Slow Fade （Molecular Probes）.
光学 成像
被标记 结构的 荧光光 学图像
激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。
带通滤色镜(BP)：有宽、窄带之分。如：BP450-490 长、短通滤色镜组合（LP + KP）：LP450 + KP490
双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。
488nm
520nm
阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490
Kd值：为Ca2+解离常数，指示检测Ca2+浓度的范围: 0.1xKd-10xkd —和很多因素有关（pH、 Mg2+、温度、与蛋白的结合、等） 细胞内生理Ca2+浓度值：10-100nM 细胞内Ca2+超载浓度值：基础Ca2+浓度的10倍左右
荧光探针
FLuo3-AM, Calcium Green-1 Calcium Green-2 Fura red Oregon Green 488
描)
DAPI (必须 顺序扫描)
活细胞追踪
△ 能被细胞主动摄取、对细胞无毒性作用、能在活细胞内长时间
存在、随细胞分裂进入子细胞 ()
△ 显微注射；转基因技术 （GFP；GFP-ACTIN）
3. 3-D样本制备的基本原则
1.固定
醛类：4%中性甲醛 – 结构保存好，但抗体渗透差；+ 0.1%Triton 有机溶剂：丙酮、甲醇 – 有利抗体渗透；部分抗原可能被抽提