祁自柏体外诊断试剂的分类和基本原理

TPA+
TPA
e
-
e-
+ Platinum electrode +
Magnet
在电场的作用下，三丙胺 （TPA） 被氧化成阳离子自由基TPA+， 后者很不稳定，可自发失去一个质子（H+），形成自由基TPA，这是 一种很强的还原剂，可将一个电子给三价的三联吡啶钌衍生物
[Ru(bpy)3]3+，使其形成激发态的[Ru(bpy)3]2+，而TPA自身被氧化 成二丙胺和丙醛。 激发态的[Ru(bpy)3]2+通过荧光机制衰减，发射出 一个波长620nm的光子，重新生成基态的[Ru(bpy)3]2+。该过程在电 极表面周而复始地进行，产生许多光子，光电倍增管检测光强度，光 强度与[Ru(bpy)3]2+的浓度呈线性关系，故可测出待测抗原的含量。
疫比浊法） • 乳胶凝集：沙门氏菌乳胶凝集试剂盒
抗原
• 抗原：指进入有免疫活性的组织 （宿主）而引发免疫应答的物质。 或虽不能引发免疫，但可以同抗体 结合的物质。
蛋白质，多糖，核酸，糖脂，青霉 素
• 全抗原性具有多个抗原决定族
抗体
• 宿主对体内存在的外来分子，微生 物或其他因子的应答而产生的蛋白 质（免疫球蛋白，丙种球蛋白）
（第四类）蛋白芯片（微阵列）类试剂 （第五类）单抗类试剂
（第六类）多抗类试剂 （第七类）诊断血清（菌液） （第八类）血球凝集类试剂
蛋白芯片（微阵列）：丙型肝炎病毒抗体检测试剂盒（蛋白芯片法）；多肿瘤标志 物检测试剂盒（蛋白芯片法）
血型定型类试剂：血型定型试剂盒（单克隆抗体） 免疫组化：ImmuChem免疫组化试剂盒（单抗） 免疫比浊：血清载脂蛋白A1免疫比浊试剂盒 乳胶凝集：D-dimer二聚体乳胶凝集试剂盒
结构简单、性能稳定 但灵敏度低、线性范围较窄。
单光子计数器是目前高灵敏度 发光分析仪的核心部件
激发光阴极 产生光电子
在各打拿极之间得到 能量和数目的倍增
在阳极上形 成较强信号
发光样品 产生光子
高 压 高速分频器
光电倍增管 高速比较器
相对发光单位 数字脉冲(RLU)
脉冲信号
高速放大器
冲洗液
流动池检测方式示意图
（第九类）核酸扩增类试剂
荧光PCR：乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒 PCR-ELISA：结核分支杆菌检测试剂盒（核酸扩增酶联免疫法） PCR-毛细管电泳：性染色体多倍体（分型与突变）检测试剂盒； PCR-电泳：α-地中海贫血基因诊断试剂盒（gap-PCR法） 转录介导扩增（TMA）：沙眼衣原体与结核分枝杆菌检测试剂盒
• 多肿瘤标志物检测试剂盒（蛋白芯片法）
NS4
NS4
NS3
NS3
总
总
C
C
NS5
NS5
（C代表核心,NS3,NS4,NS5代表 非结构区抗原）
阳
阴
空
性
性
白
对
对
对
照
照
照
每张芯片检测48个样本，每个样本同时检测5个指标，
丙型肝炎病毒分片断抗体检测蛋白芯片
（第五类） 单抗类试剂
• 血型定型类试剂：血型定型试剂盒（单 克隆抗体）
几种主要的酶联免疫方法模式
1 双抗体夹心法应用 HBsAg, HBeAg, HBcAg, pres1, pres2 2 双抗原夹心法 应用 抗HBs，抗HIV 3竞争法 应用 抗HBc, 抗pres2 4 中和抑制法 应用 抗Hbe 5 捕获法 应用 抗HBc IgM 6 间接法应用 抗HCV, 抗HEV,
AMPPD及其衍生物 的化学发光系统
（AP）
O-
O
OCH3 O
*
+
O-
光子 (477nm)
非酶促化学发光及电化学发光
• 非酶促化学发光：以吖啶酯、过氧化
氢为发光系统，不需要酶的催化。仪器 成本高，技术复杂，尚未国产化（Abbott)
• 电化学发光：氧化反应是通过电极上的
电化学反应产生，标记物为三氯联吡啶 钌。仪器成本高，技术复杂，尚未国产 化。（Roche）
3 + control band (serum addition)
Capsid NS3-1
NS3-2 GLD HCV BLOT 3.0
NS4 NS5
1+ control band (reagent addition)
（第四类） 蛋白芯片（微阵列）类试剂
• 蛋白芯片（微阵列）：丙型肝炎病毒抗 体检测试剂盒（蛋白芯片法）；
• 胶体金法：梅毒抗体-乙肝表面抗原诊断 试剂盒
• 胶体硒法：HIV(1+2+0)试剂盒
胶体金试剂原理
硝酸纤维膜
加样
检测区 对照区
(HBsAg)
----------------------------- 玻璃纤维膜
-------------------
抗HBs 羊抗鼠
鼠抗HBs
胶体金免疫层析法反应示意图
✓ 重组表达蛋白：c33c，NS5 ✓ 合成肽抗原：c100p（5-1-1p），c22p
IgG control II
IgG control I
ID
c100(p) c33c c22(p) NS5 hSOD 5-1-1(p)
RIBA模式图
Pos Pos IND IND Neg
3+ Control NS5 c100-3 c33c c22-3 SOD 1+ Control
商业化产品中常见的化学发光系统（三）
吖
啶
CH3
CH3
CH3
酯 化
N+
N
OH-
H2O2
H+
N + H2O
学
C=O O
HO C=O O
HOO C=O O
发
光
系
R
R
R
统 /
CH3 N
CH3
OH
N
非
光子 + CO2 +
+
酶
O
O C=O R
促
O
电化学发光法原理
发光
Ru2+
激发态
Ru2+
基态
e-
Ru3
+
TPA H+
干燥空气
检测器
负压泵
四通阀 计量泵
检测池
样品管
原位进样泵
氧化剂
废液
优点：结构简单，运行成本低 缺点：明显的易产生交叉污染，工作效 率受限。
常见进口发光免疫分析产品
生产厂商 ROCHE
ABBOTT Bayer Beckman DPC 强生
生物梅里埃 PE(Wallac)
产品技术类型 电化学发光、磁微珠 化学发光、磁微珠 化学发光、磁微珠 化学发光、磁微珠 化学发光、塑料球 化学发光 化学发光 时间分辨荧光
2 八十年代初期，放射免疫测定(RIA)，
抗HBs单克隆抗体
3 八十年代中期，酶联免疫试剂，基因工程表达乙肝
病毒核心抗原和e抗原
4 九十年代， 聚合酶链反应(PCR)，丙肝，戊肝
病毒基因被克隆，各种基因工程抗
原被应用
5 近期，
发光免疫,生物芯片技术(基因芯片，
蛋白芯片)
（第一类）
酶联免疫（酶标板、磁珠、微粒 子）类试剂
包被C线
上样垫
胶体金垫
N
C
膜
吸样垫
包被T线
支撑物
HIV胶体金类快速诊断试剂检测结 果
第三类） 免疫印迹试剂
• 免疫印迹试剂盒: 风湿病自身抗体检测试 剂盒（免疫印迹法）
免疫印迹法示意图
RIBA® HCV 3.0
用于RR样品的HCV抗体确认 独特的IgG（I/II）及hSOD内部质控设计 用于检测的固相化抗原
反应体系
碱性磷酸酶、吖啶酯 吖啶酯 碱性磷酸酶 碱性磷酸酶 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶
产品特点 肿瘤标志物 乙肝项目 内分泌项目
药物分析 丙肝 HIV
仪器类型 E170 I 2000 ADVIA Centaur UniCel DxI 800 Immuline2000
（第二类） 胶体金（硒、乳胶）类试剂
时间分辨荧光法：游离甲状腺素（FT4）定量测定试剂盒 电化学发光法：甲型肝炎病毒抗体诊断试剂盒
微粒子酶免法：丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒
（第二类）胶体金（硒、乳胶）类试剂
胶体金法：梅毒抗体-乙肝表面抗原诊断试剂盒 胶体硒法：HIV(1+2+0)试剂盒
（第三类）免疫印迹试剂
免疫印迹试剂盒: 风湿病自身抗体检测试剂盒（免疫印迹法）
发光免疫试剂
• 1.抗原抗体反应的基本原理及方法模式与 酶联免疫试剂完全相同
• 2.检测光信号，其光信号可因酶催化而产 生也可用其他方法使其产生
酶促化学发光
• 以酶为催化剂，通过氧化反应，使 底物发光。 过氧化物酶（HRP )促发光，底 物——鲁米诺 碱性磷酸酶(AP )促发光，底物——
商业化产品中常见的化学发光系统（一）
酶联免疫试剂
• 抗原抗体之间的特异反应与酶的高效催 化反应有机的结合。 固相 样品 放大
• 抗原 抗体 抗抗体-酶-底物-显色 • 抗体 抗原 抗体-酶-底物-显色
丙肝抗原 ELISA试剂
HRP酶 单克隆抗体
HRP 酶标记抗HCV抗体
酶标板
样品中HCV 抗原 抗 HCV 抗体
HIV-1 p24抗原检测试剂的原理
鲁米诺及其衍生物的增敏化学发光系统（HRP）
O
NH NH
NH2 O
O
NH
-N2
NH
OOH
NH2 O
OH
*
O O
NH2 O
OH
O +光
O
NH2 O
鲁米诺及其衍生物的增强剂（Enhancer）
R
OH
OH
RLeabharlann BOHN OH
S R
商业化产品中常见的化学发光系统（二）
O O OCH3 AP
O O OCH3
OPO32-
• 免疫组化：ImmuChem免疫组化试剂盒 （单抗）
• 免疫比浊：血清载脂蛋白A1免疫比浊试 剂盒
• 乳胶凝集：D-dimer二聚体乳胶凝集试剂 盒
（第六类） 多抗类试剂
• 血型定型类试剂：血型定型试剂盒（人 血清/马血清）
• 免疫组化：癌胚抗原检测试剂盒（多抗） • 免疫比浊：β-微球蛋白测定试剂盒（免
酶类化学试剂:丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定试剂盒；碱性磷酸酶（ALP）测定试剂盒 凝血试剂:凝血酶原时间（PT）测定试剂盒；组织纤溶酶原激活物（t-PT）测定试剂盒
（第十三类）
普通生化类试剂（清洁环境）（包括一 般化学试剂、血气电解质类、血液分析 仪用试剂类等）
一般化学试剂：无机离子（铝、镉等）测定试剂盒；白蛋白测定试剂盒（BCG法）；总胆固醇测 定试剂盒（COD-CE-PAP法） 血气电解质:电解质分析仪随机试剂；生化分析仪用稀释液、冲洗液 血液分析仪用试剂: 血液分析仪用稀释液、溶血剂
祁自柏体外诊断试剂的分类和基 本原理
十六个体系考核类型分类表
分类
产品型别及产品举例
（第一类）酶联免疫（酶标板、磁珠、微粒子） 类试剂
酶联免疫法：乙型肝炎病毒e抗体诊断试剂盒（酶联免疫法）；癌胚抗原定量测定试 剂盒(免疫荧光法) 化学发光法：人生长激素（GH）定量测定试剂盒 增强化学发光免疫分析法：巨细胞病毒抗体检测试剂盒
• 根据抗体性质：多克隆抗体，单克 隆抗体
• 根据抗体分子结构：IgA, D, E, G, M
抗体模式图
IgM
IgG
单克隆抗体
• 由一株淋巴细胞产生，针对一种抗原决 定族
• 抗原免疫小鼠-取脾脏-与瘤细胞融合-克 隆筛选-单克隆抗体细胞株
• 酶联免疫法：乙型肝炎病毒e抗体诊断试剂盒（酶 联免疫法）；
• 癌胚抗原定量测定试剂盒(免疫荧光法) • 化学发光法：人生长激素（GH）定量测定试剂盒
• 增强化学发光免疫分析法：巨细胞病毒抗体检测 试剂盒
• 时间分辨荧光法：游离甲状腺素（FT4）定量测 定试剂盒
• 电化学发光法：甲型肝炎病毒抗体诊断试剂盒 • 微粒子酶免法：丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒
血型定型类试剂：血型定型试剂盒（人血清/马血清） 免疫组化：癌胚抗原检测试剂盒（多抗） 免疫比浊：β-微球蛋白测定试剂盒（免疫比浊法） 乳胶凝集：沙门氏菌乳胶凝集试剂盒
诊断血清：侵袭性大肠埃希氏菌诊断血清；志贺氏菌属四种混合多价血清 诊断菌液：伤寒沙门菌菌体（O）抗原、鞭毛（H）抗原诊断菌液
抗体致敏血球：破伤风抗体诊断试剂（血凝法）；白喉抗体诊断试剂（血凝法）
（第十四类） 干化学类试剂
（第十五类） 药敏类试剂
（第十六类） 培养基类
干化学试剂（条、卡或盒）：干化学尿液分析试纸条；尿微量白蛋白（UALB）测试卡 药敏纸片（卡）：抗生素药敏纸片；随机专用药敏试剂（盒）（卡） 马丁干粉培养基；人胚胎干细胞无血清培养基
我国体外试剂的几个发展阶段
1 七十年代末， 乳胶凝集，血球凝(PHA,RPHA）
时间分辨荧光
• 将三价稀土离子铕（Eu）等通过 络合物标记到抗原或抗体分子上， 通过检测铕等的荧光实现免疫分析
应注意环境及样品中同类元素导致 的本底干扰，特别是北方地区
时间分辨荧光增强原理
发光信号检测
光敏二极管、光敏电池、光电偶合器（CCD） 原理：
光信号
光电转换器件
电压或电流信号
放大
主要特点
第十类） 基因芯片（微阵列）类试剂
（第十一类） 探针放大（原位杂交）类试剂
基因芯片（微阵列）：α-地中海贫血基因芯片诊断试剂盒 PCR-杂交：人乳头瘤病毒基因分型检测试剂盒（PCR-反向杂交法）
bDNA类：HIV-1 bDNA 检测试剂盒；mRNA检测试剂盒(生物素原位杂交法)
（第十二类）
普通生化类试剂（十万级要求）（包括 酶类化学试剂、凝血试剂类等试剂）