花生DNA快速提取方法及应用

收稿日期：２０１９－０７－２４ 基金项目：国家自然科学基金项目（Ｕ１７０４２３２）；河南省产业技术体系（Ｓ２０１２－０５－Ｇ０３） 作者简介：李柯（１９９５—），男，河南南阳人，硕士研究生。 通讯作者：殷冬梅（１９７２—），女，河南南阳人，博士，教授，主要从事花生遗传育种工作。Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｉｎｄｍ＠１２６．ｃｏｍ
关键词：花生；ＤＮＡ快速提取；碱裂解法 中图分类号：Ｓ５６５．２ 文献标识号：Ａ 文章编号：１００１－４９４２（２０１９）０９－００６８－０５
Ａ ＲａｐｉｄＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｏｆＰｅａｎｕｔＤＮＡ ａｎｄＩｔｓＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ＬｉＫｅ，ＺｈａｏＫｕｎｋｕｎ，ＮｉｎｇＬｏｎｇｌｏｎｇ，ＭａＱｉａｎ，ＬｉＺｈｏｎｇｆｅｎｇ，ＭａＸｉｎｇｌｉ，ＺｈａｎｇＸｉｎｇｇｕｏ，ＹｉｎＤｏｎｇｍｅｉ
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ Ｐｅａｎｕｔ；ＲａｐｉｄＤＮＡｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；Ａｌｋａｌｉｎｅｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄ
花生是世界上主要油料作物之一，其出油率 远远高于油菜、大豆、芝麻、向日葵等其他油料作 物。在我国油料生产中，花生种植面积仅次于油 菜，而单产和总产居第一位。随着植物分子研究 的进一步发展，可通过分子标记选择育种、大规模 杂交后代单株基因型鉴定等方式获得高蛋白、高 油酸、抗 病 抗 逆、适 产 的 花 生 品 种［１］。 分 子 标 记 辅助选择技术能够快速对目标性状进行筛选，而 植物基因组 ＤＮＡ的提取是该方法的基础［２］。一 般实验 室 提 取 ＤＮＡ 的 方 法 有 ＣＴＡＢ法［３］、ＳＬＳ
山 东 农 业 科 学 ２０１９，５１（９）：６８～７２ ＤＯＩ：１０．１４０８３／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－４９４２．２０１９．０９．０１０
ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ
花生 ＤＮＡ快速提取方法及应用
李柯，赵昆昆，宁龙龙，马倩，李忠峰，马兴立，张幸果，殷冬梅
（河南农业大学农学院，河南 郑州 ４５０００２）
第 ９期 李柯，等：花生 ＤＮＡ快速提取方法及应用
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取过程中要用一些有毒试剂，会对研究者的身体 造成危害［７］。因此，寻找一种简单、高效、低成本 提取花生 ＤＮＡ的方法很有必要。前人对 ＤＮＡ快 速提取 方 法 已 经 进 行 了 许 多 研 究。 王 蕾 等［８］开 发了一种改良 ＴＰＳ法提取花生 ＤＮＡ，不需液氮研 磨，提取 的 ＤＮＡ质 量 较 好，并 且 可 用 于 ＳＳＲ分 析。刘宇等［９］在 ＣＴＡＢ法的基础上 开 发 出 一 种 ＤＮＡ快速提取方法，并能够用于高通量测序。这 些方法虽有所改进，但步骤还是比较繁琐。Ｗａｎｇ 等［１０］建立了一种利用 ＮａＯＨ快速提取植物基因 组 ＤＮＡ的 方 法 并 成 功 应 用 于 ＰＣＲ反 应。郑 琪 等［１１］利用碱裂解法对中药炒制品的 ＤＮＡ进行快 速提取，并成功应用于 ＰＣＲ反应。徐宗昌等［１２］ 利用碱法提取烟草基因组 ＤＮＡ并应用于转基因 烟草检测。孙 莉 萍 等 ［１３］利 用 碱 裂 解 法 提 取 番 茄 ＤＮＡ并探讨了不同稀释浓度对后续 ＰＣＲ试验的 影响。此外，该方法在大麦［１４］、甘蔗［１５］、甜菜［１６］、 水稻［１７］、玉 米［１８］中 都 有 研 究。 前 人 的 研 究 证 明 碱裂解法提取的植物基因组 ＤＮＡ能够成功应用 于 ＰＣＲ反应，但该方法在花生中的应用还未见报 道。本研究对不同 ＮａＯＨ提取液浓度和是否需要 在 ＤＮＡ提取液中加入缓冲液进行了探讨，建立了 一种适用于花生的碱裂解快速 ＤＮＡ提取方法。
摘要：为了能够高效快速提取群体花生 ＤＮＡ，本研究在碱裂解法的基础上进一步简化步骤，以不同浓度 ＮａＯＨ溶液为提取液，采用直接吸取上清进行 ＰＣＲ和吸取部分上清中和后进行 ＰＣＲ，分析了两种方法的提取效 果。结果表明，用 １．０００ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ溶液裂解后，吸取部分上清中和后的 ＤＮＡ扩增效果更好，与用 ＳＬＳ常规法 提取的 ＤＮＡ质量效果相同。该方法简便快捷，在很短的时间内能够提取大量花生群体材料的 ＤＮＡ，并具有较 高的稳定性，可在花生分子标记辅助选择育种中广泛应用，为不同基因型花生的高通量快速筛选奠定了基础。
法、ＳＤＳ法［４］、高盐低 ｐＨ法［５］，这些方法提取的 ＤＮＡ浓度高、完整性好，但缺点也非常明显，操作 步骤繁琐复杂、耗时长，每次提取大致需要 ３～４ ｈ。
ＰＣＲ反 应 灵 敏，在 反 应 体 系 中 有 很 少 量 的 ＤＮＡ存在就 能 扩 增 出 目 标 条 带。 分 子 标 记 辅 助 选择、杂种后代纯度鉴定等工作中所需的 ＤＮＡ量 很少，并且提取的 ＤＮＡ也不需要长时间保存［６］。 当需要对大群体进行基因组 ＤＮＡ的提取时，传统 提取方法工作量巨大，效率大大降低。另外，在提
（Ｃｏｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｅｘｔｒａｃｔｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｐｅａｎｕｔＤＮＡｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙａｎｄｑｕｉｃｋｌｙ，ｔｈｅｓｔｅｐｓｗｅｒｅｆｕｒｔｈｅｒｓｉｍ ｐｌｉｆｉｅｄｂａｓｅｄｏｎｔｈｅａｌｋａｌｉｎｅｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄ．ＷｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＮａＯＨ ｓｏｌｕｔｉｏｎａｓｔｈｅｅｘｔｒａｃｔ，ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｗａｓｕｓｅｄｄｉｒｅｃｔｌｙｆｏｒＰＣＲｏｒｐａｒｔｉａｌｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｗａｓｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｄｆｏｒＰＣＲ，ａｎｄｔｈｅｅｘ ｔｒａｃｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｔｗｏｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｅｆｆｅｃｔｗａｓ ｂｅｔｔｅｒａｆｔｅｒｌｙｓｉｓｗｉｔｈ１．０００ｍｏｌ／ＬＮａＯＨｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｐａｒｔｉａｌｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｗａｓｔｈｅｓａｍｅａｓｔｈｅＤＮＡ ｑｕａｌｉｔｙｅｘｔｒａｃｔｅｄｂｙＳＬＳｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄｗａｓｓｉｍｐｌｅａｎｄｒａｐｉｄ，ｃｏｕｌｄｅｘｔｒａｃｔｔｈｅＤＮＡｏｆａ ｌａｒｇｅｎｕｍｂｅｒｏｆｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｍａｔｅｒｉａｌｓｉｎａｓｈｏｒｔｔｉｍｅ，ａｎｄｈａｄｈｉｇｈｓｔａｂｉｌｉｔｙ，ｓｏｉｔｃｏｕｌｄｂｅｗｉｄｅｌｙａｐｐｌｉｅｄｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒ－ａｓｓｉｓｔｅｄｓｅｌｅｃｔｉｏｎｂｒｅｅｄｉｎｇｏｆｐｅａｎｕｔｓ．Ｉｔｌａｉｄｔｈｅｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｆｏｒｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｒａｐｉｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｇｅｎｏｔｙｐｅｓ．