植物叶表气孔日变化规律与叶厚参数的相关性初探

植物叶表气孔日变化规律与叶厚参数的相关性初探
姚静远;李东升;郭琳;胡佳成
【摘要】气孔是植物水分散失的通道,其与叶片厚度之间存在一定关系.为对植物叶片气孔进行活体观测,采用长工作距离金相物镜加变焦显微镜头作为光学显微系统,千分尺导轨作为微调机构,结合CCD图像采集传感器,通过设计并制作适用于叶片活体观测的机械支架,搭建了植物叶片气孔活体观测装置.利用该装置对温室栽培的花生叶片进行监测,可直接获得叶片气孔面积百分比(气孔开度)的实时变化情况,采集到气孔的日变化规律,对花生叶表气孔开度与叶片厚度的关系进行分析,结果表明,花生叶片厚度与气孔开度的相关系数为-0.82,呈显著负相关.
【期刊名称】《浙江农业学报》
【年(卷),期】2015(027)001
【总页数】5页(P44-48)
【关键词】气孔开度;叶片厚度;CCD;光学显微系统
【作者】姚静远;李东升;郭琳;胡佳成
【作者单位】中国计量学院计量测试工程学院,浙江杭州310018;中国计量学院计量测试工程学院,浙江杭州310018;中国计量学院计量测试工程学院,浙江杭州310018;中国计量学院计量测试工程学院,浙江杭州310018
【正文语种】中文
【中图分类】Q94-3
气孔是植物叶表皮的一个特殊结构，一般由一对保卫细胞围成，是水分散失的通道。

外界环境变化时，植物通过改变气孔开度的大小，调节蒸腾速率以降低叶表温度、保持植物含水量，适应环境的变化［1］。

由于气孔开度的变化量是微米级的［2］，因此必须对活体气孔进行放大才能对其准确测量。

张永平等［1］分析了
东方百合叶片气孔在不同元素处理后的气孔开度情况。

Sanyal等［3］对电子扫描显微镜下观测得到的不同种番茄气孔图像进行了形态分析。

孟雷等［4］研究了减弱光照强度对水稻叶片气孔性状影响，发现光照强度减弱使各品种上三叶的气孔密度明显减少，对剑叶气孔大小也有显著影响。

范晓荣等［5］采用土培法研究了淹水和旱作条件下脱落酸(ABA)和生长素(IAA)对水稻叶片气孔状态动态变化的影响，发现2种激素对水稻叶片气孔开闭有调控作用。

程智慧等［6］以栽培番茄品种Ailsa Craig的六叶期幼苗为材料，在水培条件下研究了水分胁迫对叶片气孔传导、光合色素含量及发叶速度的影响。

结果表明，水分胁迫使气孔传导度和发叶速度降低，光合色素增加。

目前的植物气孔观测多为生物显微镜、电子显微镜下的切片观测，并且在制作切片过程中对于原始信息的保留程度无法预知，存在生理信息流失严重等问题。

本文针对现有测量方式存在的问题，采用长工作距离金相显微目镜，配合高分辨率CCD图像采集器、可变焦物镜组，搭建用于活体观测植物叶片气孔的装置，为生物气孔观测试验提供一种有效的活体观测手段，并针对叶表气孔与叶片厚度之间的关系进行研究，以花生叶片作为研究对象，在控制其他环境变量的前提下，分析花生叶表气孔开度与叶片厚度之间的相关性，为进一步研究叶表气孔开放机制提供理论依据。

1 植物气孔活体观测装置设计
叶片表面气孔大小各异，一般尺寸为6～25 μm，需在高放大倍率环境下才可实现对叶片气孔的清晰观测［7］。

根据植物叶片气孔分布的特点，选用高倍率光学显
微镜系统、图像采集系统及图像处理工具，设计适合叶片气孔活体观测的机械结构，实现对叶片气孔的活体观测，从而实现对气孔实时状态观测及信息采集。

植物气孔活体观测装置包括光学显微系统和图像采集系统两部分。

植物叶片气孔为被观测目标，通过高倍率光学显微系统对气孔图像放大，再通过CCD图像采集系统将放大后的气孔图像进行采集，经ADC处理，最后通过软件显示。

通过设定拍摄时间可定时监测叶片气孔变化情况，获取一天内叶片气孔变化规律。

通过软件获得的气孔图像通过图像处理工具分析气孔面积及单位面积内气孔面积所占百分比，用于后期数据分析。

1．1 光学显微系统
光学显微系统主要对气孔图像进行放大，主要包括金相放大物镜、变焦显微镜、调焦机构和照明机构等，如图1所示。

图1 光学显微系统Fig．1 Microscope optical system1—金相物镜;2—变焦物镜;3—同轴照明器;4—微调导轨;5—CCD图像采集器;6—套筒。

在活体观测中，由于叶片需进行呼吸作用、光合作用等生理活动，无法通过载玻片来平整被测表面，且叶片气孔主要分布在叶片下表面，因此普通立式显微镜机械结构无法满足对气孔活体测量的要求。

倒立式体式显微镜由于机械结构上的缺陷，不适用于活体观测叶片气孔，故叶片气孔活体观测装置还设计了微调导轨、支撑机构及夹紧机构。

微调导轨如图2所示，用于显微镜光学系统对焦，可实现对物镜的微调。

其与变
焦物镜之间的装配如图1所示，通过套筒固定变焦物镜同时将套筒与导轨连接，
通过转动千分尺转头可实现对显微系统的微调。

图2 微调导轨Fig．2 Fine-tuning guide
三脚架可以实现对装置的支撑，同时架构简易、成本低廉，通过在三脚架上设置转动装置可实现对光学显微系统在空间上的自由转动(图略)。

由于植物叶片表面不平整，需夹紧机构加紧被测叶片表面。

并且由于显微镜放大面积有限，所以只需对部分叶片表面进行固定即可。

通过上、下夹板固定被测叶面，上板面圆孔露出的叶面为被测面，两板间通过螺钉进行夹紧，夹紧力度可通过螺钉进行调节。

夹紧板位置可通过螺杆进行调节，螺杆上有锁紧螺母进行定位(图略)。

1．2 图像采集系统
图像采集系统主要包括CCD图像传感器和上位机等，为气孔活体观测装置的核心部分之一。

气孔图像经光学显微放大，通过图像采集传感器采集气孔图像，然后经ADC转换并传入上位机进行显示。

考虑到图像传感的灵敏度、分辨力以及成像质
量等要求，本装置采用西努光学公司的True color数码镜头CCD传感器(chargecoupled device)，像素可达130万，靶面对角线尺寸为1/2寸(8 mm)，其数字放大倍率为:数字放大倍率=显示屏对角线尺寸/CCD摄像头靶面对角线尺寸，即17寸显示屏配1/2寸CCD摄像头的数字放大倍率=17×25.4÷8=53.975。

植物气孔活体观测装置可实现对被测植物叶表气孔进行活体观测，对气孔开度进行实时采集，实物如图3所示。

图3 植物气孔活体观测装置实物图Fig．3 In vivo observation device of leaf stomata
2 叶表气孔孔径与叶片厚度关系
2．1 试验时间、地点及材料
本试验于2013年9—10月在中国计量学院生命科学学院试验田进行，实验环境
为全晴天、全光照和充分灌溉条件。

试验环境昼夜温度17～28℃，试验材料为温室栽培普通落花生，在花生成熟期选取长势相同的植株，对顶端叶片进行气孔开度及叶片厚度测定。

2．2 试验方法
叶片厚度采用杭州宏量科技有限公司开发的YI-20030A植物叶片参数测量仪进行
测定;采用植物气孔活体观测装置进行气孔图像采集(图3)。

植物叶片厚度及图像采集，监测周期为12～14 h，叶片厚度每隔15 min记录一次，气孔图像采集每30 min采集一次。

每隔3 h对被测植物灌水以保证试验在相同土壤湿度环境下进行;
晚间(18:00—次日6:00)无土壤灌溉。

2．3 数据处理
气孔图像采集使用VIS 3.0软件，气孔图像处理采用HDevelop软件。

通过 Excel 2007和SPSS 11.5软件进行数据处理、相关性分析。

2．4 结果与分析
通过对不同植物叶片气孔图像监测，发现在全晴天条件下，气孔在晚间19:00至
第二天8:00左右，气孔基本处于关闭状态，少数气孔处于微张状态(图4-a气孔1、气孔2、气孔3)。

上午8:00以后，由于光照强度增加及环境温度的升高，部分气
孔开始呈现张开趋势，环境温度为18℃，光照262×102 lx(图4-b)，并至10:00
左右气孔逐渐张开。

正午12:00左右，除少数气孔仍未张开或张开趋势较小外，其余全部气孔均呈现
较明显的张开趋势，12:00环境温度为24℃，光照为528×102 lx(图5-a)。

午后13:00至15:00，气孔均完全张开，气孔张开面积达到一天内最大值，环境温度为25～28℃，光照强度为552×102～596×102 lx(图5-b)。

下午15:00以后气孔逐渐呈现闭合趋势，至傍晚18:00左右，已有部分气孔基本
关闭，其余气孔张开面积也大大减小(图6-a)。

至19:00，除少数气孔仍处于微张
状态，多数气孔已完全关闭(图6-b);之后气孔逐渐完全关闭直至第二天上午。

分析花生叶片厚度与气孔开度间关系需先对气孔进行图像分析，计算单位视野面积内气孔面积百分比，进而获得气孔开度值，分析叶片厚度与气孔开度相关性。

图4 花生叶片气孔上午时段气孔开度Fig．4 Stomatal aperture of peanut leaf
in the morning
图5 花生叶片气孔中午时段气孔开度Fig．5 Stomatal aperture of peanut leaf at noon
图6 花生叶片气孔下午时段气孔开度Fig．6 Stomatal aperture of peanut leaf in the afternoon
由于采集到的原始气孔图像为彩色图像(图7-a)，不利于后期处理，所以必须先对原始图像进行灰度处理(图7-b);灰度处理后，气孔张开范围为黑色区域，通过阈值分割，分割出气孔区域(图7-c);然后进行腐蚀、膨胀，去除气孔周围噪声点(图7-d)，再通过软件选取气孔张开区域，计算该区域像素值(图7-e);最后，计算出被观测面积内叶片气孔面积百分比。

通过对采集图像的叶片气孔的处理，计算不同时刻单位视野面积内气孔总面积及气孔面积所占百分比，分析气孔面积变化对叶片厚度变化的影响。

分析可得日间单位叶面积内气孔面积百分比与叶片厚度变化曲线，如图8所示。

叶片厚度变化与气孔变化趋势相关，随着气孔面积的增大，叶片厚度呈减小趋势，并且两者峰谷值出现时间范围基本相同，均在14:00—15:00。

图7 气孔图像处理流程Fig．7 Image processing of leaf stomata
图8 花生叶片厚度与气孔面积日变化规律Fig．8 The diurnal variation of peanut leaf stomatal aperture and leaf thickness
使用SPSS软件进行数据分析叶片气孔面积百分比与叶片厚度的相关性，得到叶片厚度与气孔面积百分比相关系数为－0.82，说明二者之间存在负相关。

说明气孔面积变化对于叶片厚度影响显著，原因是由于光照与温度的升高造成叶片表面温度的升高，叶片为了维持正常生长体表温度，需通过蒸腾作用带走叶表热量从而造成叶片的水分散失，水分的散失造成叶片厚度相应减小。

3 小结
本研究提出了植物叶表气孔活体实时观测技术，通过观察气孔开度的变化，从微观
上研究气孔运动与相关影响因子的关系。

结合光学显微技术与图像采集技术对植物叶表气孔进行活体观测，搭建了植物气孔活体观测装置，实现了对植物叶表气孔运动的实时监测，为植物叶表气孔这一重要表征提供了一种新的观测方式。

在此基础上，以分析植物叶片厚度与叶片气孔开度的相关性为目的，借助YI-20030A植物叶片厚度精密测量仪对花生叶片厚度与叶片气孔开度的相关日变化规律进行了研究。

分析两者之间的相关关系得出:花生叶片的气孔开度(面积)变化对于叶片厚度影响显著，两者间相关系数为－0.82，呈显著负相关。

这说明植物叶片厚度对叶表气孔开度有显著影响，为进一步研究叶表气孔开放机制提供研究方向及理论基础。

参考文献:
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