基于SSR标记的四川移栽野生大茶树的遗传多样性

基于SSR标记的四川移栽野生大茶树的遗传多样性
刘冠群;谭礼强;吴祠平;李晓松;胡灿;胡尧;唐茜
【摘要】为四川大邑移栽野生大茶树种质资源的综合利用与科学保护提供参考,采用GPS定位对四川移栽野生大茶树种质资源进行编号与拍照,并对其相关性状进行调查和叶芽采集,利用9对SSR核心引物对41份野生大茶树种质资源进行全基因组基因分型及遗传多样性和亲缘关系聚类分析.结果表明:9对SSR引物在41份野生大茶树种质资源中共检测到41个等位基因和75种基因型,每对引物检测到3～7个等位基因,平均4.6个,4～18种基因型,平均8.33种.PCR扩增条带的基因多样性指数、扩增位点的多态性信息指数和杂合度分别为0.501 7～0.713 0、0.443 1～0.761 0和0.561 0～0.731 7,平均分别为0.624 9、0.571 6和0.577 2.在遗传距离为0.28处,UPGMA聚类方法将41份移栽野生大茶树种质资源分为4类.工类包含CDDY5和CDDY9,Ⅱ类包含CDDY24和CDDY32,I类和Ⅱ类均占群体样本总数的4.8％;Ⅲ类包含CDDY40、CDDY37、CDDY38、CDDY35和CDDY8,占群体样本总数的12.1％;Ⅳ类包含CDDY14、CDDY15和CDDY28等32个材料,占群体样本总数的78％.移栽野生大茶树具有丰富的遗传多样性,建议筛选具有当地特色的部分野生大茶树进行驯化栽培,并对其进行合理科学利用与保护.
【期刊名称】《贵州农业科学》
【年(卷),期】2018(046)004
【总页数】5页(P4-8)
【关键词】野生大茶树;SSR分子标记;遗传多样性;聚类分析
【作者】刘冠群;谭礼强;吴祠平;李晓松;胡灿;胡尧;唐茜
【作者单位】四川农业大学园艺学院,四川成都611130;四川农业大学园艺学院,四川成都611130;雅安市名山农业局,四川雅安625100;四川农业大学园艺学院,四川成都611130;四川农业大学园艺学院,四川成都611130;四川农业大学园艺学院,四川成都611130;四川农业大学园艺学院,四川成都611130
【正文语种】中文
【中图分类】S722
在自然环境下，生长百年以上的野生型或移栽型非人工培植的大茶树统称为野生大茶树，其枝繁叶茂，生长健壮，是茶树瑰宝，但目前对其尚无确切高度、粗度及年龄划分标准。

在我国，野生大茶树保存最多的是位于东经102°59′～103°45′、北纬30°25′～30°49′、海拔1 200 m、气候温暖、雨量充沛和云雾特多的四川省大邑县[1-3]。

其历经千百年繁衍，经自然进化和人工选择形成了丰富多样的野生大茶树种质资源。

为集中管理与保护这些大茶树，四川当地政府及相关部门对生长百年以上的野生大茶树进行了集中驯化移栽和保护，并在当地建立了“野生茶”保护区。

因此，探明这些野生大茶树的遗传多样性对研究其分布、生态环境及演变历史具有重要意义。

野生大茶树具有进化上原始、生化成分特异和抗逆性强等特点，其高茶多酚、高茶氨酸、高抗逆性和低咖啡碱等特殊基因使野生大茶树成为培育新茶品种的重要遗传资源，及作为茶树远缘杂交和基因累加等的良好基础材料[4]。

SSR标记(sequence tagged microsatellite site，STMS)是目前最常用的微卫星标记之一，具有共显性遗传、多态位点丰富和实验操作简单易行等特点。

近年来，分子标记技术在茶树种质资源鉴定、遗传多样性分析、遗传演化、遗传稳定性及分子遗传图谱构建等方面广泛应用，并取得了可喜进展[5-6]。

前人对四川大邑野生大茶树的研究主要集中在资源调查、化学成分分析及形态学鉴定等方面[7-9]，而
从分子水平对其全基因组分型及遗传多样性分析鲜见文献报道。

为此，笔者参照周萌等[10-15]的方法，利用SSR分子标记技术对41份四川大邑移栽野生大茶树种质资源的遗传多样性进行分析，旨在为四川大邑野生大茶树种质资源的综合利用及科学保护提供参考。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 叶芽采集 2016年9月采集四川人工移栽和生长在高山峡谷中的野生大茶树叶芽样品41份(表1)。

采集样品时，先用GPS对每棵野生大茶树进行精确定位，再对样品进行编号、拍照和填写登记表。

茶叶芽样品采集的基本原则：尽量采集性状差异性较大、具且野生种特性和地方品种代表性的茶叶芽，每份样品均单株采集健康新芽包裹于锡箔纸内，编号后立刻放入-196℃左右的液氮罐内保存，带回实验室再转入-80℃冰箱保存备用。

表1 41份四川野生大茶树的地理坐标及形态特征Table 1 Geographical coordinates and morphological characteristics of 41 wild tea tree materials in Sichuan编号Code采样位置Samplingsite北纬东经叶形Shape叶基Base
叶脉Vein叶齿Sawtooth密度深度CDDY130°39′989″103°23′821″近椭圆楔形8中浅CDD Y230°40′017″103°23′792″披针楔形11中浅
CDDY330°40′012″103°23′791″窄椭圆楔形8密中
CDDY430°40′006″103°23′801″近椭圆楔形10密浅
CDDY530°40′013″103°23′796″窄椭圆楔形8密深
CDDY630°40′004″103°23′797″窄椭圆楔形9密深
CDDY730°40′012″103°23′807″披针楔形9中浅CDDY830°40′014″103°23′809″披针楔形9密浅CDDY930°40′012″103°23′812″中椭圆楔形8密深
CDDY1030°40′005″103°23′806″近椭圆楔形9中浅
CDDY1130°39′999″103°23′808″中椭圆楔形8密深CDDY1230°39′990″103°23′806″宽椭圆楔形7稀深CDDY1330°39′986″103°23′810″近椭圆楔形12中浅CDDY1430°39′983″103°23′810″近椭圆楔形9中浅CDDY1530°40′005″103°23′818″近椭圆楔形8中浅CDDY1630°40′003″103°23′814″窄椭圆楔形9中浅CDDY1730°39′998″103°23′815″中椭圆楔形8中浅CDDY1830°40′009″103°23′819″披针楔形8密浅CDDY1930°41′694″103°24′657″窄椭圆楔形9密中CDDY2030°41′398″103°24′844″中椭圆楔形9稀中CDDY2130°41′403″103°24′843″中椭圆楔形7密深CDDY2230°41′397″103°24′823″中椭圆楔形8稀浅CDDY2330°41′409″103°24′819″披针形楔形8中中CDDY2430°41′417″103°24′812″披针形楔形9中浅CDDY2530°41′417″103°24′813″中椭圆楔形9中浅CDDY2630°41′414″103°24′829″披针形楔形8中浅CDDY2730°41′414″103°24′835″窄椭圆楔形8密中CDDY2830°41′413″103°24′835″窄椭圆楔形7密中CDDY2930°41′406″103°24′839″窄椭圆楔形7密浅CDDY3030°41′404″103°24′831″中椭圆楔形9中浅CDDY3130°41′401″103°24′836″中椭圆楔形7密深CDDY3230°41′398″103°24′844″中椭圆楔形7密中CDDY3330°41′399″103°24′843″窄椭圆楔形7密中CDDY3430°41′403″103°24′843″窄椭圆楔形8稀深
CDDY3530°41′404″103°24′843″中椭圆楔形9中中
CDDY3630°41′397″103°24′823″窄椭圆楔形8密中
CDDY3730°41′399″103°24′820″中椭圆楔形8密中
CDDY3830°41′409″103°24′819″披针形楔形8中浅
CDDY3930°41′417″103°24′812″窄椭圆楔形8中深
CDDY4030°41′417″103°24′813″窄椭圆楔形8稀深
CDDY4130°41′417″103°24′830″窄椭圆楔形9稀中
1.1.2 试剂及仪器 DP305植物基因组试剂盒及各类试剂，均购自天根生化科技(北京)有限公司；DYY-6C型号电泳仪，六一仪器厂生产；HT-SCZ04型号垂直电泳槽，京昌科仪生物科技有限公司生产。

1.2 茶叶形态特征调查
参照陈亮等[16]的方法对茶树叶片的长、宽、叶色、叶齿密度、叶齿深度、叶基、叶尖和叶缘等表型性状进行调查，并计算其平均值、极大值、极小值、标准差和变异系数。

1.3 DNA提取
利用天根公司的DP305植物基因组试剂盒提取茶树新梢叶芽的DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测提取茶叶总DNA的完整性，核酸仪(Bio-Rad Smartspec Plus)检测各样品提取的DNA浓度，用超纯去离子水将原液浓度稀释到浓度为30 ng/μL左右，保存于-20℃冰箱备用，用0.8%琼脂糖凝胶电泳进行PCR扩增。

1.4 SSR 引物筛选
用马建强[17]报道的引物及其序列，由上海生工生物合成有限公司合成48对引物。

然后用6个形态学差异较大的茶叶样品对48对引物进行筛选。

1.5 SSR-PCR 扩增
参照王丽鸢[18]的方法，在Bio Rad伯乐(My Cycler)仪上进行PCR扩增反应。

SSR扩增体系的总体积为15 μL:DNA模版(30 ng/μL)2 μL，SSR引物各(10
μmol/L)0.3 μL，dNTPs(10 mmol/L)0.3 μL，10×Buffer 1.5 μL，Taq酶(2.5
U/μL)0.3 μL，MgCl2 (25 mmol/L)1 μL，加ddH2O补水至15 μL。

扩增条件：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环；72℃延伸7 min，最后4℃保存。

扩增产物加入3 μL溴酚蓝，于8%聚丙烯酰胺凝胶的HT-SCZ04型垂直电泳槽中进行检测，电压160 V，时间80 min，电泳后进行银染显色，在观片灯下用高清单反照相机拍照记录并保存图片。

1.6 遗传多样性
以电泳图谱为基础，先将图形资料转换成数据资料，按照扩增带的片段大小进行记数，将SSR标记统计的分子数保存到Excel工作薄中，参照TAN等[19]的方法，利用Power Marker V 3.25软件计算每对引物扩增群体的基因多样性指数(Gene Diversity，H)和扩增位点的多态性信息(polymorphism information content，PIC)指数等。

参照高旭等[20]的方法计算群体等位基因数(Allele No，NA)和杂合
度(Heterozygosity，He)。

利用MEGA软件中的UPGMA方法进行聚类分析，并构建聚类树状图。

2 结果与分析
2.1 筛选的 SSR引物
经6个形态学差异较大茶叶样品对48对SSR引物进行筛选，获得多态性较高、
稳定性较好、带型比较清晰及鉴别能力较强的P05、A18、A114、TM056、
TM169、TM209、TM237、CsFM1058和CsFM1599等9对核心引物，可用其检测41份茶芽样品的多态性。

2.2 提取DNA 的质量
琼脂糖凝胶电泳图和核酸定量检测结果显示，提取DNA的 PCR扩增图谱带型清
晰(图1)，纯度较高(A260/A280=1.8～2.1)，可用其进行后续相应基因的信息分
析。

2.3 群体的遗传多样性
由图1和表2可知，9对引物在41份大茶树叶芽中扩增出183条多态性带，说明不同茶树材料间具有多态性。

在41份野生茶树资源中，共检测出41个等位基因和75种基因型。

其中，每对引物检测到等位基因为3～7个，平均4.6个，并以引物A18检测到的等位基因数最多，为7个；A114和TM169检测到的最少，均为3个。

每对引物检测到的基因型有4～18种，平均8.33种，并以引物A18检测到的基因型最多，为18种；TM169检测到的最少，为4种。

群体的杂合度为0.561 0～0.731 7，平均为0.577 2。

说明，群体材料间的基因交流较频繁。

9对引物扩增条带的基因多样性指数和扩增位点的多态性信息指数分别为0.501 7～0.713 0和0.443 1～0.761 0，平均为0.624 9和0.571 6。

其中，引物A18扩增条带的基因多样性和扩增位点多态性最高，分别为0.790 0和0.7 61 0；TM169最低，分别为0.5071和0.4431。

PIC是引物区分材料差异的能力，不仅与基因型数目有关，还与基因型的频率有关。

图1 TM169和TM237 引物对41份野生茶叶芽提取DNA 的PCR 扩增图谱Fig.1 PCR amplified patterns of 41 wild tea tree bud with primer TM169 and TM237表2 9个SSR 引物对41份茶叶提取DNA 的扩增结果Table 2 Amplified results of 41 wild tea tree materials with nine SSR primers
引物Primers引物序列ForwardPrimer(5＇～3＇)ReversePrimer(5＇～3＇)预期产物(bp)Size退火温度(℃)Annealingtemperature等位基因(个)Alleles基因型(种)GenotypesHHePICP05GCGTCGTCCCTTCTTTCTAA23258550．53440．70 000．4847GGGCAGCCATAACCACTACTA18ACGCTTCTGTTTGGTCTATT1735 87180．79000．65850．7610GATCTTGCTCATCCCTTCACA114TAGCTTTGAT CTTCCTTCGCT21358350．57850．65850．4897AACCCTGGAGCCTGAGTM
056TTGTTGGGTAGCTTTACTTGC27158470．68740．73170．6228TCAGGA CGATTATGAGGATTATM169AATAAGGCTACTCTTGG19358340．50710．51 220．4431CGGCATTGTCTTTCAGTTM209AAGGAAAATCTATGGTGAA17458 5110．71300．51220．6645ATGGTCAATGCTTGGAGTM237TTGGGAAACAA GAGTGA23458460．51670．56100．4724TCTGGGACGAGGATAATCsFM10 58CCCCTCCATCTATCTCCCTC162585110．71360．73170．6667GGACTGTT GTTGGGGAAGAACsFM1599GGCCCTGTTTTTACACTCCA16758580．58330．64310．5395GATTGGTTTCTGGTTCGCAT总量Total4175---平均Average4．468．330．62490．57720．5716
2.4 41份野生茶树的亲缘关系
从图2看出，在遗传距离为0.28处，UPGMA聚类分析方法将41份四川野生大茶树种质资源分为4类。

Ⅰ类包含CDDY5和CDDY9，Ⅱ类包含CDDY24和CDDY32，Ⅰ类和Ⅱ类分别占群体样本总数的4.8%；Ⅲ类包含CDDY40、CDDY37、CDDY38、CDDY35和CDDY8，占群体样本总数的12.1%；Ⅳ类包含CDDY14、CDDY15和CDDY28等32个材料，占群体样本总数的78%。

说明，大多数四川野生大茶树都聚在第Ⅳ类。

图2 41份野生茶树叶芽的 UPGMA聚类图谱
Fig.2 Dendrogram of 41 wild tea tree bud based on UPGMA markers
3 结论与讨论
1) 研究结果表明，9对SSR引物在41份野生大茶树种质资源中扩增出183条多态性带，共检测出41个等位基因和75种基因型。

每对引物检测到3～7个等位基因，平均4.6个；基因型4～18种，平均8.33种。

9对引物扩增条带的基因多样性指数和扩增位点的多态性信息指数分别为0.501 7～0.713 0和0.443 1～0.761 0，平均为0.624 9和0.571 6；杂合度为0.561 0～0.731 7，平均为
0.577 2。

2) 研究结果显示，在遗传距离为0.28处，UPGMA聚类分析方法将41份野生茶
树分为4类。

Ⅰ类包含CDDY5和CDDY9，Ⅱ类包含CDDY24和CDDY32，Ⅰ
类和Ⅱ类分别占群体样本总数的4.8%；Ⅲ类包含CDDY40、CDDY37、CDDY38、CDDY35和CDDY8，占群体样本总数的12.1%；Ⅳ类包含CDDY14、CDDY15
和CDDY28等32个材料，占群体样本总数的78%。

3) 由于野生茶树一般都生长在偏远山区，数量稀少，采摘困难，且资源的特异性
分布不均，如果检测基因的位点较少，则研究结果可能发生偏差。

因此，随着野生茶树采集样点及品种鉴定数量的增加，建议增加有效核心引物建立分子指纹图谱数据库，保证分子鉴定数据的准确性、及时性和实用性[21]，并扩大其应用范围。

4) 传统的茶树分类方法主要是采用形态分类，而多数形态性状受环境影响会出现
数量性状连续变异，且不同品种间某些性状的相似度较高。

因此，仅根据形态观察较难准确判定茶树类型。

而SSR分子标记技术因具有共显性、多态性相对丰富、
基因组覆盖较全和操作简便、快速、稳定性高等优点而被广泛应用于植物种质资源及品种鉴定方面。

目前，其在大麦、玉米、水稻、高粱、百合、西瓜、辣椒、黄瓜、苹果和小麦等[22]作物上广泛应用，且我国已颁布了基于SSR标记法的品种鉴定
技术国家标准。

由于该技术在茶树上的应用研究起步较晚，近年茶树的全基因组测序工作刚完成，因此，利用SSR标记鉴定茶树品种的国家标准将成为现实[23]。

5) 由于城镇化建设的加快及森林砍伐和自然灾害等的影响，四川野生茶树的部分
野生种和野生近缘种已近或正在灭绝，随着绿色、纯天然和保健食品的建立，部分野生茶树作为原生态饮品正在被开发利用，但无序的掠夺性采摘和挖掘，将加剧野生茶树种群数量的减少和濒临灭绝。

部分品质和生长较差茶树品种的遗弃将导致其基因源丢失。

因此，这种现象应引起当地政府及科研机构重视，合理科学的利用野生茶资源。

建议筛选具有当地特色的精品野生茶进行驯化栽培，对濒临灭绝的特异
品种进行积极抢救和培植保护[24]，利用生物技术加强野生茶树的保护与利用研究，充分发掘各类优异茶资源，拓展和丰富茶树基因库。

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