认识三角形浙教版

很高的多态性。

根据ES T-SSR的多态性和含有这些SSR的DNA序列比对分别构建了系统树,两种分析发现冷季型禾本科牧草模式种Lolium temulentum和他们研究的羊茅属(Lolium)和黑麦草属(Festuca)的大部分种有比较近的亲缘关系,两种分析方法的结果表现出一致性并且与传统系统分类相吻合,表明ES T-SSR在该属物种具有很好的通用性,利用基因组信息丰富的模式植物或作物ES T-SSR标记为分子系统发育与进化分析提供了便捷。

3 存在问题及采取措施
EST-SSR作为一种新型的分子标记,尽管在遗传连锁图谱构建、比较遗传作图、种质资源遗传多样性评价与保护、亲缘关系鉴定与系统分析等基因组研究中具有很大优势,但同时也存在一定的缺陷,主要表现在以下几个方面:
(1)由于EST-SSR来源于序列相对保守的基因组编码区,与传统SSR标记相比较,ES T-SSR标记的多态性较低。

(2)EST-SSR多态性是主要基于微卫星重复序列数目的变化而产生的长度多态性,对于长度相同而由不同碱基重复序列组成的SSR不能有效加以区分。

(3)由于ES T仅仅是一个基因的部分序列,所以它所揭示的基因组信息不够全面,如有些调控序列等在基因表达调控中起重要作用的信息不能体现出来。

针对以上EST-SSR存在的不足,利用数量迅速增加的EST开发新的EST-SSR,增加ES T-SSR标记数量,并结合其它分子标记如RFLP、AFLP、SSR、CAPS、S NP等进行比较研究,以提高实验的可靠性和准确性。

4 前景与展望
高通用性ES T-SSR已经在遗传图谱构建、遗传多样性评价、比较遗传作图、种质资源鉴定、系统发生与进化等植物基因组研究中被广泛应用。

随着功能基因组学研究的不断深入,大量表达序列标签成为开发SSR可利用的资源,特别是水稻、拟南芥等模式植物全基因组序列的测定,源于植物基因组编码区高通用性的ES T-SSR开始在分析基因组功能如基因定位与克隆、转录图谱的构建、发掘和利用功能基因、揭示基因对于环境的适应性进化等方面发挥重要作用。

随着分子生物学技术和生物信息学的飞速发展,高通用性分子标记ES T-SSR必将有着更为广阔的应用前景。

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发酵法生产壳聚糖的研究现状
吴建国,刘清斌,甘广东
(四川理工学院生物工程系,四川自贡643000)
摘要:综述了多种生产壳聚糖的发酵方法,甲壳素脱乙酰以及壳聚糖的提取方法,分析了壳聚糖的开发利用现状。

关键词:壳聚糖;甲壳素;发酵法;提取
中图分类号:TQ92 文献标识码:A 文章编号:1004-311X(2008)04-0093-03
Development Situation of the Production of Chitosan by Fermentation
W U Jian-guo,LI U Qing-bin,GAN Guang-dong
(Sichuan University of Science &Engi neering Bio-engi neering Depart ment,Zi gong 643000,China)
Abstract :The developmen t si tuations of the production of Chitosan by vari ous fermentation methods were introduced.And deacetylation of chiti n as well as methods of extracting chitosan were reviewed.Present situation and perspectives of chitosan were discussed.Key words :chi tosan;chitin;fermen tation;separation
收稿日期:2008-01-01;修回日期:2008-05-08
作者简介:吴建国(1981-),男,安徽安庆人,在读硕士,从事发酵制品原理与技术研究,E-mail:yz520711@ 。

1 壳聚糖与甲壳素理化性质
甲壳素(chi tin)学名为聚(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧- -D-葡萄糖,又名甲壳质、壳多糖、几丁质、蟹壳素、明角壳蛋白、虫膜质、不溶性甲壳质、聚乙酰氨基葡萄糖等,与纤维素相似。

甲壳素是一种重要的天然高分子化合物,其结构与纤维素相似,也是多糖化合物中最重要的一种聚氨基葡萄糖。

甲壳素因主要来源于节肢动物如虾、蟹等的甲壳而得名。

它也广泛存在于低等植物如真菌、藻类的细胞壁中[1]。

壳聚糖(Chitosan,简称CTS)学名为聚(1,4)-2-氨基-2-脱氧- -D-葡萄糖,是甲壳素脱乙酰化而得到的一种生物高分子,是甲壳素的主要衍生物,又称脱乙酰几丁质、聚甲壳糖、甲壳胺、聚氨基葡糖、可溶性甲壳素、粘性甲壳素等。

甲壳素和壳聚糖是含氮的多糖类物质,也是自然界中唯一的天然碱性多糖,因此具有许多独特的生物活性。

甲壳素的溶解性能较差,只能溶于浓无机酸且同时发生降解,而不溶于水、稀酸、稀碱及一般有机溶剂,从而限制了甲壳素的应用。

通过脱乙酰化反应,使甲壳素转变为壳聚糖。

由于甲壳素分子结构的规整性受到破坏,壳聚糖分子中有大量游离氨的存在,壳聚糖的溶解性能较甲壳素有了很大的改善,化学性质也较活泼,兼具有甲壳素的天然、无毒、生物相容性好与易于降解等优点,所以壳聚糖有十分良好的经济应用价值,其应用范围比甲壳素大得多[2,3]。

目前壳聚糖的主要来源还是从虾蟹壳中用酸碱加工提取,其制备存在着许多不足之处:提取过程需耗费大量的酸碱,腐蚀性强,劳动强度大;所排出的废液中的有机质很高,废液量很大,严重污染环境;用浓碱进行反应时,甲壳质的分子易降解,使分子量变小,黏度减少而影响产品质量和使用。

由之,随着发酵技术的进步,用生物工程技术大规模生产甲壳素及壳聚糖将有可能成为大有前途的清洁生产方式。

本文介绍了目前生产壳聚糖的几种发酵方法。

2 生产壳聚糖的发酵方法
2.1 从虾蟹壳中制备壳聚糖
目前提取壳聚糖和甲壳素主要是从虾蟹壳中用酸碱加工提取,但最近有人提出使用发酵方法从虾蟹壳中提取壳聚糖和甲壳素。

其主要原理是利用菌丝体发酵产生的蛋白酶消耗蛋白质,以及发酵过程中微生物产生的酸消耗无机物,从而提取壳聚糖和甲壳素。

Sini T.K.,等[4]提出使用芽孢杆菌发酵产生的蛋白酶和酸降解虾壳中的蛋白质和无机物,其实验方法是将200g 的虾壳切碎加入200mL 含108CFU mL 的芽孢杆菌在粗糖培养基中,密封发酵15d,在发酵过程中能够去除虾壳中84%的蛋白质和72%的无机物,待发酵完成后取出沉淀并清洗,再经过少量弱酸碱处理和脱乙酰,提取产物通过分析,其质量达到市场标准。

韩国的W.J.Jung,等[5]首次采用连续发酵法从蟹壳中提取甲壳素,分别使用副干酪乳杆菌和粘质沙雷氏菌进行两步发酵从蟹壳中提取甲壳素,将新鲜的蟹壳2.5g 放入50ml 10%的葡萄糖溶液中,在恒温培养振荡器中利用副干酪乳杆菌在30 条件下发酵5d,恒温培养振荡器的转速为180r min,第一步发酵结束以后,过滤沉淀物并用蒸馏水清洗,再用粘质沙雷氏菌在同样条件下发酵7d,在发酵结束后去除无机物和蛋白
质的量各达到94.3%和68.9%。

2.2 黑曲霉生产壳聚糖
黑曲霉是发酵工业中常用的真菌,我国有悠久的培养和使用的历史,黑曲霉又是含甲壳素最多的真菌,因此研究和开发由黑曲霉生产壳聚糖和甲壳素的技术,对促进我国甲壳素和壳聚糖的生产发展具有十分重要的作用。

曹健和殷蔚申[6]用黑曲霉发酵生产壳聚糖,得率为9.72%,其培养基为含葡萄糖、玉米浆培养液,另加入Mg 2+,得到的壳聚糖,结果为相对分子量为8.02 104,水分为8.38%,灰分为9.24%。

2.3 米根霉生产壳聚糖
米根霉培养条件简单,是生产乳酸发酵产品的菌种。

米根霉细胞壁含有天然壳聚糖,可以通过发酵法直接进行提取,不需经浓碱脱乙酰步骤,利用米根霉发酵生产化产生品的厂家可利用发酵后的菌丝体提取壳聚糖,这不仅有利于企业开展综合利用提高经济效益,而且可以减少下持处理过程中菌丝体对环境的排放量。

陈世年[7]选用米根霉作为菌种,在32 下、220r min 下摇瓶培养72h,最终得壳聚糖产率为10.1%(占生物量干重),脱乙酰度为92%。

并提出在实验过程中应注意培养时间,生物素水平和亚胺环己酮等因素对壳聚糖产量的影响。

2.4 毛霉生产壳聚糖
以毛霉丝状真菌发酵时形成的菌丝体为原料,利用细胞中存在的甲壳素合成酶和甲壳素脱乙酰酶的自身催化作用,把细胞内合成的甲壳素转变成壳聚糖,这样就可以直接从其菌丝体提取壳聚糖。

日本Seikei 大学的Shimahara K.等首先报道用毛霉作为菌种生产壳聚糖,壳聚糖产量可占细胞干重的8%。

还有国外的许多学者也做过这方面的提取研究。

陈忻等人[8]以经过筛选的第三代雅致放射毛霉为原料,在温度28 、摇床转速250r min 、p H 7.4~7.6条件下培养45h 。

发酵后菌体经稀碱加热脱蛋白,再用稀酸处理提取壳聚糖,产品产率达15.68%,脱乙酰度达90%左右。

他们还发现培养初期菌丝体生长迅速,壳聚糖含量也迅速增加,随着培养时间延长,菌丝体中壳聚糖含量和相对分子质量逐渐下降。

因此适时收获菌体非常关键。

鲁氏毛霉的菌丝体细胞壁组成中壳聚糖含量很高,占32.7%,而甲壳素只占9.4%。

西北农林科技大学的王云阳等[9]用鲁氏毛霉发酵,采用培养基组成为:果糖20g L,牛肉膏15g L ,K 2HPO 40.75g L,MgSO 4 1.80g L,N -乙酰葡萄糖胺1.54g L,发酵条件为:温度28 ,周期48h,p H 5.0,摇瓶装液200ml L 。

鲁氏毛霉甲壳素产量为1.328g L,壳聚糖产量为0.672g L,壳聚糖占菌粉干重的7%。

2.5 犁头霉制备壳聚糖
与毛霉相比,犁头霉可利用较便宜的碳源和氮源,培养时菌丝体呈颗粒状,发酵液黏度低。

魏光等[10]选用蓝色犁头霉作为菌种,发酵72h 后菌体生物量为6g L,天然壳聚糖产量占菌丝干重的11.72%,纯度为89.36%。

此法特点也是通过发酵参数的控制,可以达到壳聚糖集约化生产,而且生产不受地理位置影响,受季节影响也比较小,生产工艺简单。

暨南大学谢德明[11]利用液体培养基摇瓶培养犁头霉属真菌,控制28~29 的培养温度和p H 值5.0,可使壳聚糖的收率达到780mg L 发酵法生产的壳聚糖成膜后,与酸碱处理甲壳素得到的产品相比在微观上的网状结构对其作为生物材料应用意义更大。

值得注意是培养温度、时间及pH 值等因素对壳聚
糖产量产生明显影响。

3 脱乙酰化及壳聚糖的提取
采用发酵方法生产壳聚糖时,发酵结束以后菌丝体中含有壳聚糖和甲壳素,甲壳素需要通过脱乙酰转变为壳聚糖。

近年来,对壳聚糖的制备提取工艺的研究十分活跃并取得了成绩,提出了许多方法,主要有以下几种:
3.1 碱液法
碱液法所要求的设备简单而且制备成本较低,人们对于甲壳素脱乙酰化的研究也主要集中于碱液法,并且获得了一些脱乙酰基速率与碱液浓度、温度的规律。

目前国内外大多研究及生产单位制备壳聚糖的方法就是碱液法,其方法是使用质量分数为40%~60%的浓碱液,在100 ~180 下进行脱乙酰处理几小时,得到可溶于稀酸的、脱乙酰度一般在80%左右的壳聚糖。

3.2 碱熔法
使用碱熔法制备的壳聚糖一般具有20个糖单元,分子量较低,这种产品不适宜于做色谱和絮凝剂用。

将甲壳素和片状固体氢氧化钾在氮气保护下,在镍坩锅中共熔。

在180 加热搅拌30min熔融物,然后小心地倒入乙醇中。

生成的胶状沉淀用水洗至中性,这样就得到了粗的壳聚糖。

将这些粗壳聚糖洗涤溶于5%甲酸中,再用稀NaOH溶液使之沉淀过滤,重复3次。

最后得到的沉淀物洗净后被溶于50 左右的0.1mol L HCl中,接着再慢慢加入浓盐酸,直至出现沉淀,这是壳聚糖的盐酸盐。

这样的产物,主链遭到降解,经透析几天,离心分离,用乙醇洗涤后,再用乙醚洗涤。

3.3 甲壳素酶法
甲壳素酶法可以节约大量的烧碱,还能解决浓碱热处理所得产品乙酰程度不均匀、分子量降低等问题,扩大了壳聚糖的应用范围。

这种方法具有很大的应用前景,但还需进一步完善。

这种方法使用甲壳素脱乙酰酶脱去甲壳素的乙酰基来制备壳聚糖,能在常温下脱乙酰基,用此脱乙酰基酶与甲壳素在缓冲溶液(p H为5.5)中30 培养48h即可获得壳聚糖。

3.4 微波法
在脱乙酰过程中,用微波辐射能技术取代传统的加热方法,是20世纪80年代后期兴起的一项有机合成新技术。

微波法不但能加快反应速度,而且黏度也明显提高,目前国内已有微波法连续生产壳聚糖的工业化专利。

微波法制备壳聚糖基本方法是将甲壳素烘干后加入50% NaOH溶液,搅拌均匀后,浸泡10min,放入微波炉内,于462W 下加热20min进行脱乙酰化处理。

将处理体系移出微波炉,经冷却离心,再用4%的醋酸抽提,过滤,用10%的NaOH溶液析出,反复冲洗至中性烘干后得壳聚糖。

可制得脱乙度为78.23%的壳聚糖。

微波在加热的同时,可能会破坏分子链中的氢键,促进分子链分散,防止结晶的进行,使NaOH溶液进入内部进行反应,而不是仅仅停留在甲壳素分子的表面,从而加快了反应速度,并且在一定程度上避免了长时间高温脱乙酰导致黏度下降的问题[12]。

4 壳聚糖的市场现状及前景展望
4.1 壳聚糖的市场概况
壳聚糖类保健品是日本特许的唯一准许宣传疗效的功能型保健食品;而欧洲及美国的营养学界称壳聚糖为六大要素之一,并投入大量人力、物力、财力研制开发生产以壳聚糖为主要原料的第四代保健食品,其中部分产品投放市场后,受到广大消费者的欢迎。

壳聚糖在国际市场上供不应求,壳聚糖多年来在国际市场上都一直保持旺市畅销的局面,故此其销售价格不断上涨。

我国具有丰富的壳聚糖生产原料,发展壳聚糖产业具有得天独厚的优势条件,市场潜力大,前景看好。

我国于80年代就曾经掀起一股壳聚糖的开发热潮,特别近几年国内外对壳聚糖的需求旺盛,常常产品供不应求[13,14]。

4.2 壳聚糖的市场前景
近些年来,随着各国对壳聚糖的认识不断提高和应用研究的进一步深化进行,壳聚糖已应用于许多领域中,其中化妆品、保健品、食品工业等行业对壳聚糖的需求增长最快;在医药、化工、造纸、农业、环保、轻纺等领域中应用不断扩大[15]。

因此,壳聚糖及其衍生物的开发应用及市场发展前景非常可观,但由于目前的生产壳聚糖主要用化学方法从虾蟹壳中提取,受原料来源和季节的影响很大,另外,由于目前壳聚糖的生产成本较高,限制了壳聚糖的大规模应用和推广。

5 结语
本文较为系统的阐述了生产壳聚糖的发酵方法及其提取方法。

发酵法生产壳聚糖不受季节、地理位置等因素的影响,同时也可解决利用甲壳生物制备壳聚糖原料收集困难等问题。

采用发酵法生产的壳聚糖,其脱乙酰度和分子量与利用甲壳动物生产的壳聚糖非常接近,其对金属离子的吸附能力远大于甲壳动物来源的壳聚糖,特别适合于重金属离子较多的废水处理,另外发酵法生产的壳聚糖制成的食品保鲜剂的抗菌能力比从甲壳动物中提取的壳聚糖也有很大的提高。

可以看出,利用发酵法生产壳聚糖具有广泛的应用前景,同时也可以大幅度减少环境污染,但由于提取所得产品的分子量低,提取收率低,有待于更进一步改进。

关于发酵方法生产壳聚糖,今后的工作应主要放在提高产量,降低成本,以及应用于大规模工业化生产。

随着发酵法生产壳聚糖技术的不断完善,相信不久之后,发酵方法将打破目前这种被动局面,取代传统的化学方法生产壳聚糖。

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