AtNCED3及AtAAO3基因启动子功能分析及其驱动CHS基因表达

AtNCED3及AtAAO3基因启动子功能分析及其驱动CHS
基因表达
魏开发
【摘要】NCED3及AAO3系ABA信号积累的关键基因,其转录调控研究是细胞ABA信号精细调节及植物抗逆分子机制阐明的关键.通过NCED3及AAO3启动子结构与功能的分析,建立了NCED3及AAO3启动子驱动CHS基因表达受干旱诱导致烟草花色变化的体系.
【期刊名称】《湖北民族学院学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2009(027)002
【总页数】5页(P121-125)
【关键词】启动子;GUS基因;CHS基因;转录调节
【作者】魏开发
【作者单位】漳州师范学院生物科学与技术系,福建漳州363000
【正文语种】中文
【中图分类】QM2.3
脱落酸(ABA)广泛参与植物生长发育、繁殖及胁迫响应等生理过程[1～3].在干旱胁迫下，植物细胞能快速启动ABA合成，实现气孔的关闭调节和抗逆的生理生化反应.在ABA信号水平控制的多酶体系中[4～9]， NCED3及 AAO3被认为是ABA
信号积累的关健酶，其基因转录调节研究是探讨ABA信号起源的关键.事实上，ABA应答基因的转录调节研究较多，而NCED3和AAO3基因转录调节的研究几
乎是空白.转录因子的分离与鉴定，是建立NCED3及AAO3基因表达调控机制及
细胞逆境信息传递路线图的前提.烟草花色改变较基于蛋白互作的酵母杂交体系简单、直观，更重要的是通过超表达结合T-DNA突变或RNA干扰技术可对非直接
互作的转录因子进行功能分析.AtNCED3及AtAAO3启动子驱动烟草花色素苷合
成关键酶基因CHS(GenBank: AF311783.1)表达，可为其转录调控研究提供一个
新体系.此外，在花色基因工程修饰中，除了使用组织特异启动子外，其它受环境
因素如温度、光照、干旱乃至化学药物等诱导的启动子也有较好的应用前景，可实现植物花色随环境因素的改变而变化，丰富植物花色基因工程内涵.
1 材料与方法
1.1 实验材料
拟南芥种子购于ABRC，烟草种子为本实验室保存，农杆菌菌株GV3101、表达载体pCAMBIA-1391及pEZS-NL等为本实验室保存，各种限制性内切酶、Taq 酶、反转录酶、T4连接酶等购于TaKaRa公司.Olig(dT)18、引物和测序由北京三博生物技术服务有限公司完成.
1.2 GUS及CHS基因表达载体构建
GUS融合蛋白表达载体NCED3 promoter-NCED3::GUS、AAO3-1 promoter-AAO3::GUS和AAO3-2 promoter-AAO3::GUS构建的PCR引物是：NCED3:5′-CTGCAGAGCAATCGTGATGGAGGGAAG-3′，5′-ACTAGTG GCGGGAGAGTTTGATGATTG-3′；AAO3-1：5′-CGACTGCAGCAAGAGA GTATCTAAGCGATTTCATT-3′，5′-CAGAGATCTACAGCCGAGCTTGAC ACTCTT-3′；AAO3-2：5′-CGACTGCAGCAAGAGAGTATCTAAGCGATTTC
A-3′，5′-CAGAGATCTCCAAGACCTTCAGATGTAGTAATG-3′； PCR程序为：
NCED3：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，67℃退火30 s，72℃延伸2 min 50 s，循环次数24，72℃延伸7 min.AAO3-1：94℃预变性5 min，94℃变性
30 s，59℃退火50 s，72℃延伸2 min 48 s，循环次数24，72℃延伸10
min.AAO3-2：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火50 s，72℃延伸
3 min 20 s，循环次数24，72℃延伸10 min.
基于pCAMBIA-1391的NCED3 promoter-NCED3::CHS表达载体构建：启动子PCR引物是，5′-CTGCAGAGCAATCGTGATGGAGGGAAG-3′，5′-CCATGGCGGGAGAGTTTGATGATTGCT-3′；CHS PCR引物为，5′-CCATGGATGGTGACCGTCGAGGAA-3′，5′-CACGTGCTAAGTAGCAACAC TGTGGAGAA-3′.PCR程序分别是94℃预变性 5 min，94℃变性30 s，67℃退火30 s，72℃延伸2 min 50 s，循环次数24，72℃延伸7 min；94℃预变性5 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min 12 s，循环次数24，72℃延伸
5 min.
基于pCAMBIA-1391的AAO3 promoter-AAO3::CHS构建，启动子PCR引物是，5′-CGACTGCAGCAAGAGAGTATCTAAGCGATTTCA-3′，5′-CCATGGCAAGACCTTCAGATGTAGTAATG-3′，PCR程序是94℃预变性5 min，94℃变性30 s，67℃退火30 s，72℃延伸2 min 50 s，循环次数24，72℃延伸
7 min.CHS基因克隆同前.
1.3 瞬时表达载体构建
用SuperscriptⅢ RNaseH- Reverse Transcriptase反转录第一链，用Pfu高保
真酶扩增NCED3及AAO3导肽片断第二链，它们的长度设计为544 bp和604 bp.扩增时，在上游均引入酶切位点Kpn I，下游均引入酶切位点Apa I，插入pEZS-NL表达载体，构建表达产物为导肽和GFP融合蛋白的瞬时表达载体.RNA
提取采用QIAGEN公司RNeasy Plant Minikit，cDNA合成采用Promega公司
的M-MLV Reverse Transcriptase(M1701).基本程序如下：取1 μg RNA，加1 μg Oligo(dT)15 ，70℃热激5 min，之后加入5 μL M-MLV buffer，1.25 μL dNTP Mix，1 μL M-MLV，0.6 μL RNase inhibitor, 采用25 μL反应体系，37℃ 反应1 h.PCR相关引物为： NCED3：5′-GGTACCATGGC TTCTTTCACGGCA-3′，5′-GGGCCCATTTGACGGCGTGAACCA-3′，AAO3：5′-GGTACCATGGATTTG GAGTTTGCAG-3′，5′-GGGCCCGATGGTCTTTGG GGTTATAAG-3′.PCR程序分别为：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，循环次数24，72℃延伸5 min；94℃预变性4 min，94℃变性30 s，55℃退火50 s，72℃延伸1 min，循环次数24，72℃延伸5 min.
1.4 稳定转化及抗性植株筛选
拟南芥Floral dip转化与抗性植株筛选参见Steven等[10]的方法，烟草遗传转化见Tang等[11]方案，并作适当修改.
1.5 GUS染色
用90%丙酮冰上固定30 min，用缓冲液(760 μL 50 mmol/L
NaHPO4(pH7.0):10 μL 50 mmol/L K3[Fe(CN)6]:10 μL 50 mmol/L
K4[Fe(CN)6])洗涤两次，后在染色液(0.5 mg X-gluc:760 μL 50 mmol/L磷酸钠
缓冲液(pH7.0):10 μL 50mmol/L K3[Fe(CN)6]:10 μL 50 mmol/L
K4[Fe(CN)6]:10 μL 0.5 mol/L EDTA:1 μl Triton X-100:200 μL甲醇)中染色.苗龄最好在5～9 d，染色5～6 h，后用70%酒精脱色数小时后观察GUS着色部位和深浅.
1.6 基因枪轰击
取干净拟南芥叶片和洋葱表皮置于MS培养基上，用纯化的pEZS-GFP-NCED3
和pEZS-GFP-AAO3质粒用基因枪轰击，22℃放置12～24 h，撕下下表皮，在
激光共聚焦显微镜下观察GFP表达部位.
1.7 基因表达半定量RT-PCR分析
参见魏开发等[9]的方法.PCR引物为：CHS：5′-GATCAAAGCACTTATCCTGAT-3′，5′-AGTAGTTCCCAAACCTTCTTT-3′；Actin2：5′-CTTCCCTCAGCACATTCCAG-3′, 5′-CCCAGCTTTTTAAGCCTT TG-3′.PCR条件为：94℃ 5 min，94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 1 min，35个循环，72℃ 7 min.
1.8 CHS基因Real Time PCR分析
Real Time PCR 采用SYBR Premix Ex Taq 试剂盒 (TaKaRa DRR041S)，PCR仪型号MJR PTC200.所用引物：5′- CGAGCATAAGGTTGAGCTTAA-3′，5′-GCCCAGGAACATCTTTGAGTA-3′. PCR条件：95 ℃ 10 s ，95℃ 5 s，57℃ 42 s ，40个循环.Real Time PCR结果分析采用2-ΔCTCT方法，以Actin2做为参照基因[12].
2 结果与分析
2.1 NCED3及AAO3启动子生物信息学及基因表达分析
图1 NCED3及AAO3基因表达组织化学定位Fig.1 NCED3 and AAO3 gene expression and histochemical localization of the proteins(A)NCED3在质体中表达;(B)AAO3在细胞质中表达;(C)NCED3受干旱诱导表达;(D)转pCAMBIA-1391空载体植株对照; (E-G)不含内含子的AAO3-1脱水胁迫表达;(H)AAO3-2受第一内含子增强表达(A)NCED3 gene expressed in the plastid;(B)AAO3 gene expressed in the cytoplasm;(C)NCED3 gene drought-inducible expression;(D)control plants transformed by pCAMBIA-1391 empty vector;(E-G)AAO3-1 expression under dehydration stress without intron;(H)AAO3-2 gene expression with the first intron to inerease expression level
植物在进化过程中为保持其功能的稳定，某些基序得到了保留，如顺式作用元件和
反式作用因子.基因是否高效快速表达受控于启动子上的顺式作用元件与相应的转
录因子的作用.通过查阅DNA序列和结构数据库(http://www.epd.isb-sib.ch/；http://transfac.gbf.de/TRANSFAC 等)对NCED3与VP14基因启动子应答于逆
境基序比对，发现NCED3存在响应ABA及脱水的元件(TACGTG、CACGTG、ACGT和ACGTG)、转录因子MYB结合的序列(CCGAC、WAACCA)、响应生物
及非生物逆境协迫的TGAGC元件、响应脱水及高盐的ACGTGKC元件等.显示NCED3表达受多路径多层次网络调控，这对于在协迫信号感知后ABA合成快速
启动和迅速积累起着重要作用.而AAO3没有应答于逆境的基序存在，说明两个基因在逆境信息应答通路上存在不同的应答模式.对AAO3及NCED3基因转录因子
的寻找是建立逆境信号转导网络，操控内源ABA信号水平的重要步骤，作者在研究中发现酪氨酸蛋白磷酸酶涉入了ABA信号调控(另文发表).
用ChloroP 1.1 Server对NCED3及AAO3序列分析，显示NCED3前40个氨
基酸为叶绿体导肽序列(cTP).SignalP 3.0 Server对NCED3信号肽分析，最有可
能的裂解位点位于20-21个氨基酸之间.另用Target P1.1 Server对AAO3进行
叶绿体导肽、线粒体导肽及分泌蛋白信号肽分析，显示没有明确信号肽存在.
从拟南芥基因组克隆NCED3启动子和导肽共2 627 bp、AAO3-1启动子到第一
外显子的2 750 bp片断，AAO3-2启动子和第1～2外显子包括内含子的3 147 bp、利用pCAMBIA-1391表达载体上PstⅠ 、BgIⅡ和SpeⅠ酶切位点引入克隆片断，表达产生NCED3::GUS、AAO3-1::GUS和AAO3-2::GUS融合蛋白. NCED3 promoter-NCED3::GUS对拟南芥的稳定表达显示，NCED3主要在叶片
叶绿体(图1A)和根尖表达，提示NCED3在质体中表达的特点.不同脱水处理时间，GUS表达呈现明显差异，4 h内脱水表达量较低 (图1C1-3)，5 h后有一定的表达(4-5)，6 h后开始上升(6-7)，7 h后明显加大了表达量(8-10)，表明NCED3受干旱脱水脱处理短时间就明显增强表达.
AAO3 promoter-AAO3::GUS表达部位在叶肉细胞(图1B)及根系维管束，其在叶肉细胞中的高表达显示AAO3对叶片ABA合成的贡献.AAO3-1::GUS表达水平(图1E-G)明显不及AAO3-2::GUS(图1H)，揭示第一内含子能增强AAO3基因表达，说明第一内含子在AAO3基因转录调控中的突出作用.
NCED3启动子受脱水高表达的特点，可用在双字叶植物基因工程方面，如脱水诱导特异功能蛋白的表达，以增强植物某方面的能力，如抗逆性.AAO3在叶片细胞和维管束组织的高水平达，为靶蛋白定位表达提供了一个平台.
图2 pEZS-NCED3和pEZS-AAO3分别在拟南芥和洋葱表皮细胞瞬时表达Fig.2 Transient expression of pEZS-NCED3 and pEZS-AAO3 in Arabidopsis and onion epidermal cell respectively
图3 胁迫条件下CHS基因表达水平变化与花色改变Fig.3 Analysis of CHS gene expression and color change under stress condition(A)不同处理对花色的影响; (B)不同处理下CHS基因半定量RT-PCR分析;(C)不同处理CHS基因相对表达量的Real Time RT-PCR分析(1.非转基因烟草；2. 非干旱胁迫下NCED3启动子驱动基因表达；3.NCED3驱动且干旱处理20 d;4.AAO3驱动未经干旱处理；5.AAO3驱动且干旱处理20 d)(A)Effect of different treatments on the flower color;(B)analysis of CHS expression gene semi-quantitative RT-PCR under different treatments;(C)Real Time RT-PCR analysis of CHS genes relative expression quantity under different treatments (1.Non-transgenic tobacco;2.NCED3 promoter-driven gene expression under non-drought condition;3.NCED3 promoter-driven gene expression under drought treatment 20 d drought treatment;4.AAO3 promoter-driven gene expression under non-drought condition;5.AAO3 promoter-driven gene expression under drought treatment 20 d drought treatment)
2.2 NCED3及AAO3亚细胞定位
基因表达定位与功能相关，基因功能实现受启动子操纵，而启动子的组织特异性及转录水平受转录调控.NCED3和AAO3在拟南芥(图2A)和洋葱表皮细胞瞬时表达(图2B)，显示NCED3和AAO3分别在叶片叶绿体和细胞质中表达，结合上述细
胞组织化学定位分析，相互印证NCED3和AAO3蛋白不同定位部位的事实.生物
信息学分析也提示两个基因在表达调控方面从属于不同的信号通路，NCED3可能直接受控于应答于逆境响应的转录因子；AAO3受脱水上调表达，但AAO3启动
子区域没有脱水胁迫影响的顺式作用元件，显示AAO3的转录调节源于更上游脱
水胁迫基因的表达.两个基因的定位不一致，表明从NCED的氧化裂解到ABA醛
的氧化过程在不同的部位进行，其中涉及到产物的跨膜转运问题.跨膜转运很有可
能关联到ABA生物合成路径中ABA前体的转运调节.
2.3 NCED3和AAO3启动子驱动烟草CHS基因表达
以AtNCED3和AtAAO3启动子驱动烟草CHS基因在烟草中稳定表达，相对于未转基因烟草(图3A1)，非干旱胁迫下转NCED3(图3A2)、AAO3(图3A4)启动子驱动CHS基因的烟草的花色没有明显变化.每处理多个(>10)重复，并且在设立严格
对照的前提下，植株经干旱处理20天后同一批花与对照比较，NCED3驱动CHS 基因表达的花瓣有显著加深(图3A3)，同时AAO3驱动的花瓣也有一定程度的花
色改变(图3A5)，说明干旱处理后转基因烟草花色发生了变化.
从基因表达的角度看(图3B)，在非干旱处理情况下，NCED3(图3B2)及AAO3(图
3B4)驱动的CHS基因表达，与非转基因烟草相比(图3B1)，CHS基因表达水平有一定程度提高，显示NCED3和AAO3启动子的基础表达活性.在干旱胁迫处理下，半定量RT-PCR分析显示，NCED3启动子驱动的CHS基因表达水平明显提高(图
3B3)，而AAO3启动子驱动的CHS基因表达水平(图3B5)也有提高但不及
NCED3表达水平，显示两启动子在干旱处理情况下不同的基因表达模式.
基因表达的Real Time RT-PCR分析，更进一步显示，干旱处理明显增强了NCED3及AAO3驱动的CHS基因表达水平(图3C)，导到烟草花色的改变.表型改变和分子生物学的实验证据相互印证，强烈揭示烟草花色变化是CHS基因表达水平受干旱胁迫影响的结果.
3 讨论
在基因转录水平研究中，研究者需要一个简单而高效的技术平台，对于影响NCED3及AAO3基因表达的转录调节研究，这一体系就可能是个选择.如果仅靠
酵母杂交系统，其技术体系的复杂性，往往让众多研究者望而止步，更重要的缺陷是，酵母杂交系统只能进行蛋白直接互作实验，无法就信号通路中非直接互作因子的关系作出推断.基于花色改变的转录水平调控体系可能是一个选项，本研究显示，烟草花色受CHS基因表达水平影响发生较明显变化，加上烟草转基因体系简单易行，超表达或RNA干扰某一转录因子的表达水平，其效应都可能在花色变化上体现出来，研究者还可以在烟草植株中重建基因表达调控体系，进行多因子的互作实验，当然，这要求不同的表达载体需要有不同的抗性筛选标记，可通过共转化及位点特异性重组做到[13].本研究，还给花色基因工程提供了一个新思路，受环境信
号调控的启动子在花色基因工程修饰方面有一定的应用价值，可以实现花色随环境条件的变化而发生改变.
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