杜梨响应盐胁迫cipk01的克隆及表达分析
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杜梨作为中国梨树栽培中普遍应用的一种砧木，具备耐
收稿日期：２０１８－０８－０３ 基金项目：国家自然科学基金（编号：３１３７２０５１、３１７７２２８７）；江苏省自
然科学基金（编号：ＢＫ２０１５１３６１）。 作者简介：王 影（１９９３—），女，安徽宿州人，硕士研究生，主要从事
果树种质资源与分子育种研究。Ｅ－ｍａｉｌ：１７５９０６８０６０＠ｑｑ．ｃｏｍ。 通信作者：常有宏，研究员，博士生导师，主要从事果树种质资源和栽
截至目前，已有越来越多的 ＣＩＰＫ基因被克隆，在模式植 物拟南芥中发现有 ２５个［６］，玉米 中 有 ４３个［７］，葡 萄［８］和 油 菜［９］中分别有 ２３个。关于 ＣＩＰＫ基因的研究目前主要集中 在拟南芥［６］、玉米［７］、水稻［１０］和甘蔗［１１］上，水稻 ＯｓＣＩＰＫｓ基 因受不 同 程 度 的 生 物 胁 迫 和 非 生 物 胁 迫 诱 导 表 达；甘 蔗 ＳｃＣＩＰＫｓ基 因 在 应 对 非 生 物 胁 迫 逆 境 中 协 同 发 挥 作 用，同 时 在生物胁迫 （接 种 花 叶 病 毒 ）下 表 现 出 差 异 表 达 水 平。 由 此 推测，杜梨 ＣＩＰＫ基因可能也受非生物胁迫的诱导表达。
王 影１，２，李 慧１，蔺 经１，杨青松１，常有宏１
（１．江苏省农业科学院果树研究所 ／江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，江苏南京 ２１００１４； ２．南京农业大学园艺学院，江苏南京 ２１００９５）
摘要：ＣＢＬ互作蛋白激酶（ＣＩＰＫ，ＣＢＬ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ）是与钙调磷酸酶 Ｂ类蛋白（ＣＢＬ，ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎＢ－ ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ）特异结合的蛋白激酶，广泛参与植物的生长发育以及生物和非生物胁迫响应。克隆和鉴定杜梨响应盐胁 迫的 ＣＩＰＫ基因，对杜梨抗逆分子机制和抗逆性研究具有重要意义。选取了一个特殊的基因 ＰｂＣＩＰＫ０１做进一步的研 究，通过生物信息学和实时荧光定量 ＰＣＲ技术分析该基因的序列特征以及在盐胁迫下的表达模式。该基因全长为 １３６８ｂｐ，含有 １３６５ｂｐ的开放阅读框，编码 ４５５个氨基酸，ＤＮＡ序列为 ５０５１ｂｐ，包含 １２个外显子和 １１个内含子。 实时荧光定量 ＰＣＲ分析结果表明，该基因在杜梨的叶片中表达量最高，且受盐胁迫诱导下调表达。 关键词：杜梨；盐胁迫；ＣＩＰＫ基因；序列分析；基因表达；抗逆基因；抗逆机制 中图分类号：Ｓ６６１．２０１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１９）２１－０１１５－０５
培技术等研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｙｈ＠ｊａａｓ．ａｃ．ｃｎ。
涝、抗寒、耐盐碱、抗旱等综合抗性，是梨属植物中重要的抗性 种质资源 ［１２］。本研究 首 先 采 用 同 源 克 隆 技 术 从 杜 梨 中 克 隆 ＣＩＰＫ基因，然后利用实时定量 ＰＣＲ技术分析该基因在盐胁 迫下不同组织和不同时间（０、１２、２４、４８、７２ｈ）的表达模式，以 期为杜梨抗逆基因的发掘和抗逆机制的解析提供理论基础。
采用 ＲＮＡＳｉｍｐｌｅＴｏｔａｌＲＮＡＫｉｔ［天根生化科技（北京）有 限公司］提取杜梨总 ＲＮＡ，经 １．５％琼脂糖凝胶电泳检测总 ＲＮＡ的 完 整 性，采 用 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴ －ＰＣＲ Ｋｉｔ试 剂 盒 （ＴａＫａＲａ）合成第一链 ｃＤＮＡ。 １．３ 杜 梨 ＣＩＰＫ基 因的 ｃＤＮＡ和基 因组 ＤＮＡ全 长 序 列 的 克隆
以中国白 梨 （Ｐｙｒｕｓ×ｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ）基 因 组 数 据 库 中 的 ＣＢＬ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ５这个基因 （ＸＭ＿０１８６４８９８９．１）作 为 电 子 探 针，搜 索 杜 梨 盐 胁 迫 转 录 组 数据库［１３］，获得候选基因，设计特异引物（Ｐ１：５′－ＡＴＧＧＴＧＡＴＣ ＧＴＧＡＧＡＡＡＡＧ－３′，Ｐ２：５′－ＡＣＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＴＣＴＴＧＧ－３′），以 未处理和 经 过 ＮａＣｌ处 理 的 杜 梨 叶 片 的 ｃＤＮＡ为 模 板 进 行 ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ反应体系为：ｃＤＮＡ１．０μＬ，引物各 １．０μＬ， １０× ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２．０μＬ，ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）３．２μＬ， ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ，ＬＡ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２μＬ，ｄｄＨ２Ｏ ９．６μＬ。反应 条件 为：９５℃ ４ｍｉｎ；９５℃ ３０ｓ，５８℃ ３０ｓ，
１ 材料与方法
１．１ 材料与胁迫处理 单株来源的杜梨组培苗保存于江苏省农业科学院果树研
究所仁果研究室。经分生根培养 ３０ｄ后，选择生长一致的植 株，移栽到温室营养土穴盘中继续培养，待幼苗长至 １０ｃｍ左 右，选取生长良好、发育一致的杜梨苗流水冲洗干净，用纸浸 干，然后分别置于去离子水和 ＮａＣｌ溶液中处理，于 ０、１２、２４、 ４８、７２ｈ分别取根、茎和叶片，用液氮速冻后保存于 －８０℃冰 箱中备用。 １．２ 总 ＲＮＡ的提取及 ｃＤＮＡ的合成
江苏农业科学 ２０１９年第 ４７卷第 ２１期
王 影，李 慧，蔺 经，等．杜梨响应盐胁迫 ＣＩＰＫ０１的克隆及表分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０１９，４７（２１）：１１５－１１９． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１９．２１．０２６
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杜梨响应盐胁迫 ＣＩＰＫ０１的克隆及表达分析
Ｃａ２＋是植物中普遍存在的第二信使，与 Ｃａ２＋传感器结合 进行信号传递，在植物抗低温、抗旱、抗盐等胁迫中发挥重要 作用。 钙 调 磷 酸 酶 Ｂ 类 蛋 白 （ＣＢＬｓ，ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎＢ －ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）作为植物体内特异的 Ｃａ２＋传感器必须与下游的靶蛋 白 ＣＢＬ 互 作 蛋 白 激 酶 （ＣＩＰＫ，ＣＢＬ －ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ）相互结合才能共同发挥作用［１］。ＣＩＰＫ是植物特有的 一类丝氨酸 ／苏氨酸蛋白激酶，该蛋白在植物响应逆境胁迫中 发挥重要作用，尤其与非生物胁迫（高盐、ＡＢＡ、干旱等）的信 号传导密切相关［２］。在模式植物拟南芥中，所有的 ＣＩＰＫ蛋 白含有 Ｃ－端的调节域和 Ｎ－端的激酶蛋白域，ＣＩＰＫ蛋白 Ｃ －端的调节区有 ２个明显功能域，是 ＮＡＦ结构域和 ＰＰＩ结构 域，ＮＡＦ结构域能与 ＣＢＬ特异结合［３］，ＰＰＩ结构域［４］是 ＣＩＰＫ 与蛋白磷酸酶的作用位点，这 ２个结构域的特性使得 ＣＩＰＫ 成为一个连接 ＣＢＬ传导信号途径的重要分子开关，使其能更 好地发挥信号调控作用［５］。
收稿日期：２０１８－０８－０３ 基金项目：国家自然科学基金（编号：３１３７２０５１、３１７７２２８７）；江苏省自
然科学基金（编号：ＢＫ２０１５１３６１）。 作者简介：王 影（１９９３—），女，安徽宿州人，硕士研究生，主要从事
果树种质资源与分子育种研究。Ｅ－ｍａｉｌ：１７５９０６８０６０＠ｑｑ．ｃｏｍ。 通信作者：常有宏，研究员，博士生导师，主要从事果树种质资源和栽
截至目前，已有越来越多的 ＣＩＰＫ基因被克隆，在模式植 物拟南芥中发现有 ２５个［６］，玉米 中 有 ４３个［７］，葡 萄［８］和 油 菜［９］中分别有 ２３个。关于 ＣＩＰＫ基因的研究目前主要集中 在拟南芥［６］、玉米［７］、水稻［１０］和甘蔗［１１］上，水稻 ＯｓＣＩＰＫｓ基 因受不 同 程 度 的 生 物 胁 迫 和 非 生 物 胁 迫 诱 导 表 达；甘 蔗 ＳｃＣＩＰＫｓ基 因 在 应 对 非 生 物 胁 迫 逆 境 中 协 同 发 挥 作 用，同 时 在生物胁迫 （接 种 花 叶 病 毒 ）下 表 现 出 差 异 表 达 水 平。 由 此 推测，杜梨 ＣＩＰＫ基因可能也受非生物胁迫的诱导表达。
王 影１，２，李 慧１，蔺 经１，杨青松１，常有宏１
（１．江苏省农业科学院果树研究所 ／江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，江苏南京 ２１００１４； ２．南京农业大学园艺学院，江苏南京 ２１００９５）
摘要：ＣＢＬ互作蛋白激酶（ＣＩＰＫ，ＣＢＬ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ）是与钙调磷酸酶 Ｂ类蛋白（ＣＢＬ，ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎＢ－ ｌｉｋｅｐｒｏｔｅｉｎ）特异结合的蛋白激酶，广泛参与植物的生长发育以及生物和非生物胁迫响应。克隆和鉴定杜梨响应盐胁 迫的 ＣＩＰＫ基因，对杜梨抗逆分子机制和抗逆性研究具有重要意义。选取了一个特殊的基因 ＰｂＣＩＰＫ０１做进一步的研 究，通过生物信息学和实时荧光定量 ＰＣＲ技术分析该基因的序列特征以及在盐胁迫下的表达模式。该基因全长为 １３６８ｂｐ，含有 １３６５ｂｐ的开放阅读框，编码 ４５５个氨基酸，ＤＮＡ序列为 ５０５１ｂｐ，包含 １２个外显子和 １１个内含子。 实时荧光定量 ＰＣＲ分析结果表明，该基因在杜梨的叶片中表达量最高，且受盐胁迫诱导下调表达。 关键词：杜梨；盐胁迫；ＣＩＰＫ基因；序列分析；基因表达；抗逆基因；抗逆机制 中图分类号：Ｓ６６１．２０１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２－１３０２（２０１９）２１－０１１５－０５
培技术等研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｙｈ＠ｊａａｓ．ａｃ．ｃｎ。
涝、抗寒、耐盐碱、抗旱等综合抗性，是梨属植物中重要的抗性 种质资源 ［１２］。本研究 首 先 采 用 同 源 克 隆 技 术 从 杜 梨 中 克 隆 ＣＩＰＫ基因，然后利用实时定量 ＰＣＲ技术分析该基因在盐胁 迫下不同组织和不同时间（０、１２、２４、４８、７２ｈ）的表达模式，以 期为杜梨抗逆基因的发掘和抗逆机制的解析提供理论基础。
采用 ＲＮＡＳｉｍｐｌｅＴｏｔａｌＲＮＡＫｉｔ［天根生化科技（北京）有 限公司］提取杜梨总 ＲＮＡ，经 １．５％琼脂糖凝胶电泳检测总 ＲＮＡ的 完 整 性，采 用 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴ －ＰＣＲ Ｋｉｔ试 剂 盒 （ＴａＫａＲａ）合成第一链 ｃＤＮＡ。 １．３ 杜 梨 ＣＩＰＫ基 因的 ｃＤＮＡ和基 因组 ＤＮＡ全 长 序 列 的 克隆
以中国白 梨 （Ｐｙｒｕｓ×ｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ）基 因 组 数 据 库 中 的 ＣＢＬ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ－ ｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ５这个基因 （ＸＭ＿０１８６４８９８９．１）作 为 电 子 探 针，搜 索 杜 梨 盐 胁 迫 转 录 组 数据库［１３］，获得候选基因，设计特异引物（Ｐ１：５′－ＡＴＧＧＴＧＡＴＣ ＧＴＧＡＧＡＡＡＡＧ－３′，Ｐ２：５′－ＡＣＴＡＧＴＣＡＧＣＡＡＣＴＣＴＴＧＧ－３′），以 未处理和 经 过 ＮａＣｌ处 理 的 杜 梨 叶 片 的 ｃＤＮＡ为 模 板 进 行 ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ反应体系为：ｃＤＮＡ１．０μＬ，引物各 １．０μＬ， １０× ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ２．０μＬ，ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）３．２μＬ， ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）２．０μＬ，ＬＡ Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ）０．２μＬ，ｄｄＨ２Ｏ ９．６μＬ。反应 条件 为：９５℃ ４ｍｉｎ；９５℃ ３０ｓ，５８℃ ３０ｓ，
１ 材料与方法
１．１ 材料与胁迫处理 单株来源的杜梨组培苗保存于江苏省农业科学院果树研
究所仁果研究室。经分生根培养 ３０ｄ后，选择生长一致的植 株，移栽到温室营养土穴盘中继续培养，待幼苗长至 １０ｃｍ左 右，选取生长良好、发育一致的杜梨苗流水冲洗干净，用纸浸 干，然后分别置于去离子水和 ＮａＣｌ溶液中处理，于 ０、１２、２４、 ４８、７２ｈ分别取根、茎和叶片，用液氮速冻后保存于 －８０℃冰 箱中备用。 １．２ 总 ＲＮＡ的提取及 ｃＤＮＡ的合成
江苏农业科学 ２０１９年第 ４７卷第 ２１期
王 影，李 慧，蔺 经，等．杜梨响应盐胁迫 ＣＩＰＫ０１的克隆及表分析［Ｊ］．江苏农业科学，２０１９，４７（２１）：１１５－１１９． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１９．２１．０２６
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杜梨响应盐胁迫 ＣＩＰＫ０１的克隆及表达分析
Ｃａ２＋是植物中普遍存在的第二信使，与 Ｃａ２＋传感器结合 进行信号传递，在植物抗低温、抗旱、抗盐等胁迫中发挥重要 作用。 钙 调 磷 酸 酶 Ｂ 类 蛋 白 （ＣＢＬｓ，ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎＢ －ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）作为植物体内特异的 Ｃａ２＋传感器必须与下游的靶蛋 白 ＣＢＬ 互 作 蛋 白 激 酶 （ＣＩＰＫ，ＣＢＬ －ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ）相互结合才能共同发挥作用［１］。ＣＩＰＫ是植物特有的 一类丝氨酸 ／苏氨酸蛋白激酶，该蛋白在植物响应逆境胁迫中 发挥重要作用，尤其与非生物胁迫（高盐、ＡＢＡ、干旱等）的信 号传导密切相关［２］。在模式植物拟南芥中，所有的 ＣＩＰＫ蛋 白含有 Ｃ－端的调节域和 Ｎ－端的激酶蛋白域，ＣＩＰＫ蛋白 Ｃ －端的调节区有 ２个明显功能域，是 ＮＡＦ结构域和 ＰＰＩ结构 域，ＮＡＦ结构域能与 ＣＢＬ特异结合［３］，ＰＰＩ结构域［４］是 ＣＩＰＫ 与蛋白磷酸酶的作用位点，这 ２个结构域的特性使得 ＣＩＰＫ 成为一个连接 ＣＢＬ传导信号途径的重要分子开关，使其能更 好地发挥信号调控作用［５］。