LOX-1特异性小发夹RNA表达载体的构建及其效应

Ｏ— Ｄ （ Ｘ Ｌ Ｌ 中国医学科学 院基础医学研究所 ）Ｌ Ｘ １ ；Ｏ 一 单克隆抗 体 （ａ ｔ Ｃｕ ， 国）蛋 白抽提试剂盒（ ｅｌｉｎｌ ｇ 美国） Ｓｎａ ｒｚ美 ； Ｃ ｌｓ ａ ｎ ， ｇ ｉ 。
１ 方 法 ． ２ １ ． ｓＲ Ａ 的 设 计 及 ｐ ｅ ｅｉ １ ｓＲ Ａ 的 构 建 ：根 据 ．１ ｈＮ ２ Ｇ ｎ ｓ 一 一ｈ Ｎ ｌ
３）和 阴性 对 照 Ｈ —ｈ Ｎ （ Ｋ ｓＲ Ａ 特异 性 寡核苷 酸序列为 ５一
ＧＡＣ Ｔ Ｔ Ｔ ＣＡ ＡＡＧＧＣ ＡＴ ＧＣ ＧＣ一 ｏ Ｌ —１ ＯＬ — ＧＡＰ ３ Ｏ Ｒ１ 、 Ｒ１ ２、 ＤＨ
１１ 材 料 ． Ｔ Ｎ ｉ ｓ 、ａ Ｈ Ｉ、 ｉｄＩ、ａ Ｉ（ ４Ｄ Ａ Ｌｇ ｅ Ｂ ｍ Ｈ ｎ Ｉ Ｓ ｌ 大连 宝 生 物 工 程 ａ Ｉ 有 限 公 司 ） Ｔｉ ｌ（ ｌ ｕａ ｅｅｒｈＣ ｎ ｒＩｃ ；油 红 ０ ｒ ｏ Ｍｏ ｃ ｌ Ｒ ｓａｃ ｅｔ ， ） ｚ ｅ ｒ ｅ ｎ
Ｇ ｎ ａｋ提供 的 Ｌ Ｘ １ 因序列 （ Ｌ 为 Ｎ １８ ４ ）通 ｅＢｎ Ｏ 一 基 Ｏ Ｒ１ Ｍ一 ３ ６８ ，
表 １ Ｏ Ｒ１Ｇ Ｐ Ｈ及 ＨＫ质粒模板序列 Ｌ Ａ Ｄ 质粒名称 模板序列
５－ ＇ＣＡＣＣＧＴ ＣＡＧＴＧＡＣＣＣ ＡＴＴ Ａ Ｔｒ ＧＴ Ｉ ＴＣＡＡＧＡＣＧＴ ＡＡＴＡＡＧＧＧ ＡＣ ＴＣＡＣＴ ＧＡＣＴｒｒ ＴＴ Ｇ一 ｒ ３
的基因沉默技术 ，能抑制靶 基因的转 录。本研究通 过构建
ＬＸ １ Ｏ 一 基因的发卡样 ｓ Ｎ ｓＲ Ａ） 核表达载体 ， ｉ Ａ（ｈ Ｎ 真 Ｒ 并检测 其对 Ｌ Ｘ一 基 因和蛋 白表达 的抑 制效应及 Ｒ Ｗ２４７细胞 Ｏ １ Ａ ６．
对 ＤｌＯ— Ｄ ｉ Ｘ Ｌ Ｌ摄 取 的 影 响 。 —
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４２ ・
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Ｓ Ｒｍ ｄ ｓ ｌｉ ， ｎａ １．０１． ． ｅ ｅ ｅｉ ＆Ｃｉｔ Ｊ ｕｒ２ ０ １ｏ ｏ１ ｅ ｎ８ａ ｙ０ ｖ ． Ｎ
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基 础 ｘＩ ・ ０－ 究
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ＬＸ １ Ｏ 一 特异性小发夹 Ｒ Ａ表达载体 的构建及 其效应 Ｎ
１ 材 料 和方 法
和 Ｈｎ 之间设计一个 Ｓｌ ｉｄｌ ｌ Ｉ ａ Ｉ的酶切位点 （ 武汉晶赛生物工 程技术有限公司合成 ）另外还合成阳性对照 Ｇ Ｐ Ｈ ｓＲ Ａ 。 Ａ Ｄ —ｈ Ｎ
（ 异 性 寡 核 苷 酸 序 列 为 ５一 Ｇ Ｇ Ａ Ａ Ｙ ３＂Ｃ Ａ Ｃ 特 Ａ Ｔ Ｇ Ｔ Ｔ Ｇ ３ Ｃ Ｔ Ａ一 Ｇ
Ｆｒ ｅ ｔ ）Ｒ — Ｃ ｅｍ ｎａ ， Ｔ Ｐ Ｒ试 剂 盒 、引物 （ 连 宝 生 物有 限公 司 ） ｓ 大 ；
箱培养过夜。从每个培养皿上各挑取 ３ 个单克隆菌落接种于
３ｍ Ｌ含 Ｋ ｎｒ ａａ 抗性 （ 终浓度为 ３ ｇＬ ０ｍ ／）的 Ｌ Ｂ培养基 中，７ ３ ℃恒温摇床（ ５ ｒｎ 培养过夜 。用小提试剂盒小量提取质 ２ ０ｄ ｉ） ａ 粒（ 中鼎公 司）并 分别用 ｓ ｌ 做酶切鉴 定 ，％Ａ ａｅ ， ａＩ １ ｇｓ 凝胶 电 泳。送转化菌液测序鉴定 。
及 ＨＫ正 义链 和反 义 链 序列 见 表 １ 义 和反 义 链 经 过 变性 、 。正
复性后 形 成双链 Ｌ Ｘ ｌ ｓＲ Ａ Ｏ — —ｈ Ｎ 。采用 Ｄ Ａ重组技 术 ， Ｎ 将 Ｌ Ｘ一 一ｈ Ｎ Ｏ １ ｓＲ Ａ双链 与线 性化 ｐ ｅｅｉ ｌ 粒表 达 载体 连 Ｇ ｎｓ — 质 ｌ 接。 各取 ５ ｌ 过夜连接产物转化感受态细胞 Ｄ ａ分别涂布 Ｈ５ ，
边云飞 李茂莲 杨慧宇 杨志明 高 奋 张娜娜 肖传 实
氧化型低 密度 脂蛋 白（Ｘ Ｌ Ｌ 在动脉粥 样硬化形成 和 Ｏ— Ｄ ）
过 Ｂａｔ ｌ 挑选 ２个长为 １ ｓ ９个碱基的特 异性寡核苷酸序列 ｆ 序
歹 （ Ｌ — ） ５ 一 Ｔ Ａ Ｔ Ａ Ｃ Ｔ Ａ Ｉ Ｔ ３ ． 列 ２ ＵＩ Ｏ Ｒ１ １ 为 Ｇ Ｃ Ｇ Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｔ ＇ Ａ一 序 Ｇ
于含 Ｋ ｎｒ ａ ａ抗性 （ 终浓度为 ３ ｇ ） Ｌ ０ｍ ／ 的 Ｂ平板上 ．７℃恒温 Ｌ ３
（ｉｍ 公 司，美 国） ｓ ａ ｇ ；总胆 固醇和游离胆固醇试剂盒 ［ ａｉ ｉ Ｄ ｉｈ ｃ
ｐｒ ｈｍｉ ｌ Ｃ ， ｕｅｃｅ ｃ ｓ ｏ 日本） ＤｌＯ— Ｄ （ｉ 公司 ， ａ ； ｉ Ｘ Ｌ Ｌ ｓ ｍａ — ｇ 美国）； 逆 转 录试 剂 盒 （ ｅｅｔｉＴ ｉ ｔ ｔ ｎ ｄ ａＳｎｈｓ ｉ Ｒ ｖｒ ｄ Ｍ Ｆｒ ｒ ｄ Ｃ ｎ ｙ ｔ ｉ Ｋｔ Ａ ｓ ｓａ ｅｓ ，
化的形成和发展过程 中发挥了重要作用 。 抑制 Ｌ Ｘ １ Ｏ 一 的表达
将有利于防止动脉粥样硬化的形成 。 Ｎ Ｒ Ａ干扰是一种特异性
Ｉ＋ ｅｓ＋ ｏｐ Ａ ｔｅｓ＋ Ｓ ｎｅ Ｌ ｏ ＋ ｎｉ ｎｅ 终止信号＋ ａ Ｉ Ｈｎ ｄ ｌ 同时合 ｓ Ｓ ＋ ｉ— ， ｌ ｎ
成互 补链 ， 线性化 ｐ ｅｅｉ ｌ Ｇ ｎｓ — 质粒表达 载体 （ ｌ 武汉晶赛生 物 工程技术有 限公司 ） Ｂ ｍ ＋ ｉｄ Ｉ 用 ａ Ｈ Ｉ Ｈ ｎ １双酶 切 ． Ｂ ｍ 在 ａ ＨＩ
发展过程 中起着关键的作用 ， 而血凝 素样 氧化 型低 密度脂蛋
白受体 １Ｌ Ｘ １是 Ｏ— Ｄ （ Ｏ 一 ） Ｘ Ｌ Ｌ在血管 内皮细胞上的主要受体 ， 它在介导 ０— Ｄ ｘ Ｌ Ｌ对血管内皮细 胞的损伤 、参与动脉粥样硬
（ Ｌ － ） ５－ Ｔ Ｇ Ｃ Ｇ Ｙ Ｃ Ａ Ｃ Ａ Ｔ ３ ， Ｏ Ｒ１ ２ 为 Ｇ Ｇ Ｃ Ａ Ｔ Ａ Ｔ Ａ Ａ 一 分别 成 其发卡样两端配对的 ｓ Ｎ ｉ Ａ寡核苷酸链 ． Ｒ 引物结构 为 Ｂ ｍ Ｈ ａ－