GDNF和EGFP双基因共表达重组杆状病毒载体的构建及鉴定

GDNF和EGFP双基因共表达重组杆状病毒载体的构建及鉴
定
陈艳春;王俊;王士礼;蔡昌枰;李彪;张一帆;郭睿
【摘要】目的构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的重组杆状病毒载体.方法将目的基因(EGFP和GDNF)克隆人杆状病毒表达载体pFastBacDual中,构建重组质粒pFB-EGFP-GDNF并予酶切鉴定;将pFB-EGFP-GDNF转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中,获得重组杆状病毒载体Bacmid-EGFP-GDNF,抽提质粒并行PCR鉴定;脂质体转染法将Bacmid-EGFP-GDNF转染Sf9细胞包装病毒;免疫荧光法检测Sf9细胞EGFP和GDNF蛋白表达.结果目的基因片段正确插入pFastBacDual载体中;重组Bacmid 正确;Bacmid-EGFP-GDNF包装转染成功,获得较高病毒滴度;免疫荧光检测表明,Sf9细胞中GDNF和EGFP蛋白共表达.结论成功构建重组杆状病毒Bacmid-EGFP-GDNF,转染SD细胞共表达GDNF和EGFP蛋白,为进一步研究GDNF蛋白对内耳的保护作用奠定了实验基础.%Objective To construct a novel enhanced green fluorescent protein (EGFP) and glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) recombinant baculovirus. Methods The target gene(EGFP and GDNF) was cloned into baculovirus transfer vector pFastBacDual, pFB-EGFP-GDNF was constructed and restriction enzyme analysis was conducted. pFB-EGFP-GDNF was transposited with baculovirus shuttle vector (Bacmid) into DH10Bac competent cells, and recombination baculovirus vector Bacmid-EGFP-GDNF was constructed. The plasmid was extracted and PCR was performed for identification. Bacmid-EGFP-GDNF was transfected with Sf9 insect cell package virus by liposomal transfection
method. Immunofluorescent staining was employed to detect the expression of EGFP and GDNF protein in St9 cells. Results The target gene fragment was correctly cloned into pFastBaeDual vector, and recombinant Bacmid was constructed. Bacmid-EGFP-GDNF was successfully transfected, and higher virus titer was obtained. The coexpression of GDNF and EGFP protein in Sf9 cells was identified by immunofluorescent staining. Conclusion The recombinant baculovirus Bacmid-EGFP-GDNF can be successfully constructed, and the protein of EGFP and GDNF is coexpressed in St9 cells, which paves a way for the research of GDNF gene therapy.
【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2009(029)007
【总页数】4页(P821-824)
【关键词】胶质细胞源性神经营养因子;增强型绿色荧光蛋白;杆状病毒;蛋白表达【作者】陈艳春;王俊;王士礼;蔡昌枰;李彪;张一帆;郭睿
【作者单位】上海交通大学,医学院瑞金医院耳鼻咽喉科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院耳鼻咽喉科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院耳鼻咽喉科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院耳鼻咽喉科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院核医学科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院核医学科,上海,200025;上海交通大学,医学院瑞金医院核医学科,上海,200025
【正文语种】中文
【中图分类】Q78;R764
感音神经性聋是影响人类生活质量主要的问题，基因治疗被认为是感音神经性聋最有希望的治疗方法之一。

杆状病毒(baculovirus，Bac)载体是表达效率最高的新型载体。

目前有关杆状病毒在介导多基因表达方面的研究仍少见报道。

胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor, GDNF) 是目前发现的活性最强的神经营养因子之一。

实验[1-2]证明,GDNF对强噪声或氨基糖甙类抗生素引起的听力和毛细胞损伤有显著的保护作用，并可促进噪声损伤后螺旋神经节细胞和毛细胞的存活。

由于GDNF是一种大分子蛋白质，难以通过血
脑屏障到达局部病变组织，成为阻碍其临床应用的主要原因。

基因治疗是解决这一问题的途径之一，即通过体内转基因的方法使其表达分泌GDNF，从而使病变部
位GDNF可以持续表达并释放，实现其神经营养功能。

本研究通过构建携带增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)和GDNF的重组杆状病毒载体，转染宿主细胞(Sf9细胞)后免疫荧光法鉴定EGFP和GDNF共表达，探讨杆状病毒载体作为多基因治疗载体的可行性，旨在
为进一步研究GDNF蛋白对内耳的保护作用奠定实验基础，同时为基因治疗的示
踪提供简单和有效的方法。

1 材料与方法
1.1 主要材料质粒pAAV-GDNF(上海交通大学医学院附属瑞金医院神经研究所宋怀东教授惠赠)；质粒pFastBacDual-EGFP(上海交通大学附属瑞金医院核医学科
实验室保存)；大肠杆菌DH5α感受态菌(天根生物公司)；质粒中量抽提试剂盒、
大肠杆菌DH10Bac感受态菌、脂质体Cellfectin、PCR反应试剂盒(Invitrogen)；内切酶BamHⅠ、内切酶SalⅠ和T4DNA连接酶(NEB)；胶回收试剂盒(Qigen)；PCR检测M13引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)；Sf9细胞(本实验室保
存)；Sf900Ⅱ培养液(Gibco)；羊抗大鼠GDNF特异性抗体(Santa Cruz)；TRITC
标记的兔抗山羊二抗(上海西唐生物工司)；SH P-150生化培养箱(上海精宏实验设备有限公司)；MF41荧光显微镜 (Olympus)。

1.2 重组载体质粒构建与鉴定37 ℃下，质粒pAAV-GDNF用BamHⅠ和SalⅠ双酶切8 h，胶回收目的片段GDNF；质粒pFastBacDual-EGFP用BamHⅠ和
SalⅠ双酶切9 h，胶回收载体pFastBacDual-EGFP。

目的片段和载体用 T4DNA
连接酶在16 ℃连接20 h，转化大肠杆菌DH5α感受态菌，取100 μL转化产物
涂于Gm++Amp+的LB平板，挑取克隆菌在Gm++Amp+的LB培养液中摇菌，抽提质粒进行酶切鉴定。

该质粒下文中称pFB-EGFP-GDNF。

1.3 重组杆状病毒载体质粒构建与鉴定按照Invitrogen公司的说明，用pFB- EGFP-GDNF转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态菌，在含X-gal、IPTG、四环素、卡那霉素和庆大霉素的LB培养平板中，37 ℃下生
长48 h，挑取白色单克隆菌重新划板，37 ℃下过夜，最后挑取确定的白色单克隆菌落在含四环素、卡那霉素和庆大霉素的LB培养液中摇菌24 h。

按照Invitrogen公司的说明，提取、纯化Bacmid，PCR技术鉴定Bacmid中目的基
因插入情况。

该质粒下文中称Bacmid-EGFP-GDNF。

1.4 Bacmid-EGFP-GDNF转染Sf9细胞用脂质体转染法包装Bacmid-EGFP-GDNF转染Sf9细胞。

Sf9细胞培养于Sf 900Ⅱ培养液中。

在6孔板中接种
5×105个细胞，加入2 mL Sf900Ⅱ培养液，在27 ℃生化培养箱中贴壁至少1 h。

准备转染试剂，上下颠倒5～10次混匀，取6 μL，在A、B两个EP管中分别加
入100 μL Sf 900Ⅱ培养液(不含FBS和抗生素)，A管中加入5 μL Bacmid-EGFP-GDNF，B管中加入6 μL脂质体Cellfectin，混合A、B管，室温静置30 min。

弃6孔板中培养原液，用2 mL Sf 900Ⅱ培养液(不含FBS和抗生素)洗1次，加入脂质混合物，补充Sf 900Ⅱ培养液(不含FBS和抗生素)至0.8 mL，轻柔混合，
27 ℃培养5 h。

弃转染混合物，加入2 mL含抗生素的Sf 900Ⅱ培养液，继续培
养72 h，收集上清液，其中含有重组杆状病毒(P0期)。

1.5 Sf9细胞EGFP和GDNF蛋白共表达及鉴定①空斑实验测定P0期病毒滴度：用2 mL Sf9细胞(5×105 /mL)接种入6孔板，室温孵育至少1 h，使其贴壁；将
P0期病毒用Sf 900Ⅱ培养液(不含FBS和抗生素)梯度稀释(10-1～10-8)；弃6孔板内上清，快速加入稀释好的病毒(1 mL/孔)，设复孔，室温孵育1 h；弃6孔板
上清，快速加入2 mL上层琼脂，以防菌层干燥，静置10～20 min，使其凝固；将6孔板放入27 ℃培养箱，培养4～10 d，计数孔中噬菌斑数，按公式(病毒滴
度=1/稀释倍数×噬菌斑数×1/每孔接种体积)计算病毒滴度为3×107。

②P0期病
毒再感染sf9细胞：用P0期病毒上清以感染复数(MOI)0.1再感染Sf9细胞，获
得EGFP和GDNF蛋白大量表达。

③免疫荧光法鉴定：对培养的Sf9细胞用PBS
洗涤3遍，4%冷的多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤3遍；0.2%Triton X-100通透10 min，PBS洗涤3遍；5%BSA封闭30 min，PBS洗涤3遍；加一抗
(1∶500稀释)4 ℃湿盒内过夜，PBS洗涤3遍，加二抗(稀释为1∶100)室温避光
2 h，PBS洗涤3遍，直接照射荧光，在同一视野下分别用红、绿色激发光激发摄取荧光图像，其中红色荧光标记GDNF蛋白，绿色荧光为EGFP蛋白。

2 结果
2.1 重组质粒pFB-EGFP-GDNF鉴定利用BamHⅠ和SalⅠ双酶切重组质粒，酶
切后经1.2%琼脂糖凝胶电泳，显示有约650 bp的DNA片段(图1)，表明目的片段已经成功重组入载体中。

图1 重组质粒pFB-EGFP-GDNF酶切鉴定Fig 1 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid pFB-EGFP-GDNFM: marker; 1: product of pFB-EGFP-GDNF digested by BamHⅠand SalⅠ
2.2 重组质粒Bacmid-EGFP-GDNF鉴定 PCR反应产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳，
显示有5000bp的条带，提示目的片段已经重组在Bacmid中(图2)。

2.3 EGFP和GDNF蛋白表达鉴定在荧光显微镜下同一视野中分别用相应的激发
光照射，观察结果显示，Sf9细胞中EGFP和GDNF蛋白共表达成功(图3)。

图2 PCR技术鉴定重组质粒Bacmid-EGFP-GDNFFig 2 Identification of recombinant plasmid Bacmid-EGFP-GDNF by PCRM: marker; 1: PCR product of Bacmid-EGFP-GDNF
图3 免疫荧光法检测Sf9细胞EGFP和GDNF蛋白表达×200Fig 3 Detection of EGFP and GDNF expression in Sf9 cells by immunofluorescent staining
×200A：GDNF expression；B：EGFP expression
3 讨论
合适的载体是基因治疗能否达到预期目的的关键。

本研究采用的杆状病毒系统是一类应用前景非常广阔的病毒载体。

杆状病毒目前主要应用在两个方面：其一是作为表达系统，是基因工程四大表达系统之一；其二是作为基因转移载体转运目的基因，应用于基因治疗。

杆状病毒系统是一种真核表达系统，其安全性高，能够容纳较大的外源基因，重组病毒易于筛选，并且具有完备的翻译后加工修饰系统和高效的表达外源基因的能力。

本研究选用的杆状病毒载体是1993年Luckow等利用噬菌体复制子构建的新型AcMNPV载体系统，采用的是晚期基因增强启动子,即多角体蛋白基因ph启动子和p10基因启动子,它们可以高效表达目的蛋白。

该系统分Bacmid穿梭载体、供体质粒和辅助质粒三部分。

Bac-to-Bac表达系统是由转座子介导的杆状病毒重组
系统。

该系统中，卡那霉素抗性基因、Tn7基因转座子靶位点attTn7、来源于pUC质粒的LacZ肽段编码基因以及mimi-F复制子被克隆进AcMNPV多角体蛋白基因位点，这种经过修饰的AcMNPV称之为Bacmid。

Bacmid作为穿梭载体，既可感染鳞翅目昆虫，又可以在E.coli中复制。

供体质粒为pFastBac，携带有外
源目的基因，辅助质粒编码转座酶，供体质粒中的外源基因在转座酶作用下，插入到Bacmid中，干扰了LacZ的表达，这样可以通过细菌菌落蓝白筛选重组Bacmid质粒DNA。

再将重组的Bacmid质粒DNA转染昆虫细胞即可获得重组病毒。

本研究选用杆状病毒的pFastBacDual供体质粒，它拥有相互间具有一定竞争性的双启动子(ph启动子和p10启动子)，可同时大量表达两个目的基因。

双表达的蛋白能够保持各自独立的活性[3-4]。

本研究构建的杆状病毒携带EGFP和GDNF基因。

EGFP蛋白能在蓝色激发光的照射下发出绿色荧光，荧光特性十分稳定，不易卒灭，对细胞无毒害，不影响细胞的正常生长和功能。

GDNF是近年来才发现且被证明具有确定生物学活性的一种神经营养因子[5]，在促进神经细胞的功能维持和损伤修复方面有着其他神经营养因子不能比拟的强效作用。

对豚鼠噪声损伤实验[6]发现，在噪声损伤之前或损伤后2 h给予外源性GDNF，可避免耳蜗感觉细胞受损和听力丧失。

GDNF对噪声和耳毒性药物等引起的听力和毛细胞损失，具有明显的保护作用。

Hakuba等[7]研究发现，GDNF 对耳蜗缺血引起的听力和毛细胞损伤有明显保护作用。

外源性GDNF不能通过血脑屏障，而且由于耳蜗结构的特殊性，GDNF的应用受到了极大的限制。

在前期实验[8]中，我们已经利用杆状病毒携带绿色荧光蛋白成功转染耳蜗螺旋神经节细胞和Corti器。

在此基础上本实验成功构建重组杆状病毒载体质粒Bacmid-EGFP-GDNF，获得了较高的病毒滴度，并在Sf9细胞中成功双表达GDNF和EGFP蛋白。

本研究构建的重组杆状病毒将作为一个基因转染载体，为深入研究GDNF蛋白对内耳的保护作用奠定了实验基础。

参考文献:
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[7]Hakuba N, Watabe K, Hyodo J, et al. Adenovirus-mediated overexpression of a gene prevents hearing loss and progressive inner hair cell loss after transient cohchlear ischemia in gerbils[J]. Gene Ther, 2003, 10(5): 426-433.
[8] Wang J, Li B, Cai C, et al. Efficient transduction of spiral ganglion neurons in vitro by baculovirus vectors[J]. Neuroreport, 2007,18(13): 1329-1333.。