固相萃取净化-高效液相色谱测定水果中赤霉素、多效唑、烯效唑残留量

固相萃取净化-高效液相色谱测定水果中赤霉素、多效唑、烯
效唑残留量
张敏;闫超杰;付海滨;李修平;徐宜宏
【摘要】建立了一种简单、快速,同时检测水果中赤霉素、多效唑和烯效唑残留量的固相萃取-高效液相色谱(SPE-HPLC)方法.该方法经80％甲醇水提取样品,C18固相萃取小柱净化,采用DAD检测器220 nm紫外扫描检测.结果表明:3种植物生长调节剂在0.5～10 μg/mL内线性关系良好(r≥0.999)；检出限分别为赤霉素0.002 mg/kg、多效唑0.04 mg/kg、烯效唑0.02 mg/kg；在0.2～0.8 mg/kg加标水平下,3种植物生长调节剂平均回收率为78％～91％；相对标准偏差为2.4％～5.4％.
【期刊名称】《食品与发酵工业》
【年(卷),期】2014(040)002
【总页数】4页(P192-195)
【关键词】固相萃取;高效液相色谱;水果;赤霉素;多效唑;烯效唑;残留
【作者】张敏;闫超杰;付海滨;李修平;徐宜宏
【作者单位】沈阳农业大学工程学院,辽宁沈阳,110866;锦州出入境检验检疫局,辽宁锦州,121013;沈阳出入境检验检疫局,辽宁沈阳,110016;济宁出入境检验检疫局,山东济宁,272100;沈阳出入境检验检疫局,辽宁沈阳,110016
【正文语种】中文
近年来，植物生长调节剂在水果和蔬菜生产中得到了广泛的应用。

赤霉素、多效唑和烯效唑是我国应用较为广泛的3种植物生长调节剂。

赤霉素在植物生长发育的各个阶段都起到调节作用，尤其对蔬菜水果具有显著的增产效果;而多效唑和烯效唑可以抑制赤霉素的合成，有效控制植物徒长，提高农产品的品质和产量。

植物生长调节剂与农药一样，大量使用也会在作物中残留，人体长期食用后在体内积蓄，造成慢性中毒，并可能引起癌变［1］。

目前，美国、日本等国规定水果和蔬菜中赤霉素最高残留限量为0.2 mg/kg，国际食品法典委员会(CAC)规定苹果和核果类水果中多效唑最高残留限量标准分别为为0.5 mg/kg和0.05 mg/kg［2］，日本规定草莓中烯效唑最高残留限量为0.1 mg/kg［3］。

因此，为了保证我国的食品安全和果蔬贸易的顺利开展，应建立快速、准确且通用的赤霉素、多效唑和烯效唑残留检测方法。

据报道，张慧建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定苹果中的赤霉素、多效唑和烯效唑残留量［4］;王静静等建立了HPLC-MS/MS法测定水果中残留的多效唑和烯效唑［5-6］。

可见目前对于赤霉素、多效唑和烯效唑的多残留检测仅限于液相色谱-串联质谱仪的方法，而最基础的液相色谱法对这3种植物生长调节剂的同时检测未见报道。

当前我国基层各检测单位和企业大多还没有条件配备液相色谱-串联质谱仪，因此，本研究旨在利用高效液相色谱技术建立赤霉素、多效唑和烯效唑的残留检测方法。

1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
1.1.1 试剂和耗材
标准品:赤霉素(Gibberellin)、多效唑(Paclobutrazol)、烯效唑(Uniconazole)标准物质，购置于北京陆桥公司，纯度均为99%以上。

C18固相萃取小柱(1 000 mg/6 mL)，迪马公司。

乙腈、甲醇(色谱纯)，迪马公司;其他试剂均为分析纯;实验用水均为二次蒸馏水。

1.1.2 仪器和设备
1100高效液相色谱仪(配DAD检测器)，美国安捷伦公司;BT2202S(0.01g)电子天平，赛多利斯公司;IKA-T25高速均质器，德国伊卡公司;WAT200609固相萃取仪，美国WATERS公司;2-6离心机，德国Sigma公司;IKA-MS3涡旋混合器，德国伊卡公司;HSC-12A氮吹仪，南京科捷仪器公司。

1.2 实验方法
1.2.1 标准溶液的配制
准确称取赤霉素、多效唑、烯效唑标准品各10 mg，用甲醇溶解后定容至10 mL，配成质量浓度为1 000 μg/mL的单标溶液。

准确移取单标溶液各1 mL于10 mL 容量瓶中，定容得到质量浓度为100 μg/mL的混合标准储备液，4℃下保存。

试
验中稀释制备成所需要的系列标准溶液。

1.2.2 样品前处理
1.2.2.1 提取
称取切碎后的水果样品10 g(精确至0.01g)于100 mL的离心管中，加入20 mL
体积分数80%甲醇提取剂，18 000 r/min条件下均质30 s，超声提取20 min，
将提取液10 000 r/min离心5 min，取上清液进行下一步净化。

1.2.2.2 净化
分别用5 mL甲醇和5 mL水预处理C18固相萃取小柱，取5 mL提取液过柱，再分别用5 mL水和5%甲醇水5 mL淋洗，弃去淋洗液，抽干小柱后，用5 mL甲
醇洗脱，室温条件下氮气吹干洗脱液，用1 mL色谱纯甲醇定容，过0.22 μm滤膜，进行HPLC测定。

1.2.3 色谱条件
色谱柱:Agilent C18色谱柱(250 mm×4.6mm，5 μm);流动相:V(乙
腈)∶V(水)=55∶45;柱温:35 ℃;波长:220 nm;流速:0.8 mL/min;进样体积:20 μL。

2 结果与讨论
2.1 流动相条件优化
目前文献资料报道的植物生长调节剂残留检测大多应用有机溶剂配合酸类或盐类物质配比作为流动相［7-11］，因考虑到酸类及盐类物质对色谱柱有损害，本研究
选择常用的乙腈和甲醇与水配比作为流动相。

试验比较了乙腈/水和甲醇/水不同比例对赤霉素、多效唑、烯效唑3种植物生长调节剂分离效果，最终确定在V(乙腈):V(水)=55:45、流速0.8 mL/min的条件下，赤霉素、多效唑、烯效唑分离效
果和峰形较好，测定时间也能保证在10 min之内，结果见图1。

2.2 检测波长的选择
根据文献资料，赤霉素通常对200～210 nm紫外波长有较大吸收［8］，多效唑
对220～230 nm紫外波长有较大吸收［12］，烯效唑对230～254 nm紫外波长有较大吸收［13-14］。

本研究选择在 210、220、230 nm 3个紫外波长条件下
同时对赤霉素、多效唑、烯效唑进行色谱分析，发现在220 nm条件下，3种植物生长调节剂均有较大吸收，适用于同时检测。

2.3 固相萃取柱的选择
图1 三种植物生长调节剂1.0 μg/mL标准色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of three plant growth regulators
植物生长调节剂主要应用于水果和蔬菜中，因此选取东北地区最为常见的水果(苹
果和鸭梨)为试材进行空白和添加回收试验。

水果中含有色素、糖类和酚类等物质
可能会干扰被测物质出峰，试验中采用样品提取液直接进行色谱检测和应用C18、HLB固相萃取小柱净化检测。

通过比较发现，苹果和鸭梨加标提取液中的杂质未
干扰赤霉素、多效唑、烯效唑检测，但杂质峰面积很大，长期应用对色谱柱有损害;固相萃取柱净化后比较，HLB固相萃取柱仅对烯效唑有部分保留，其他2种物质
不能吸附，而C18固相萃取柱对3种物质有较高的保留，还能去除提取液中大部分杂质，结果见表1、图2和图3。

表1 C18与HLB固相萃取小柱添加1.0 μg/mL混标回收率对比(n=8)Table.1 Recoveries of three plant growth regulators(1.0 μg/mL)purified by C18and HLB solid-phase cartridges(n=8)/% RSD/%赤霉素名称固相萃取柱回收率
C18/% RSD/%固相萃取小柱回收率HLB 90.70±2.02 2.23 0 -多效唑
97.38±0.56 0.57 0 -烯效唑93.36±1.84 1.97 16.82±1.37 8.14
图2 鸭梨添加2.0 mg/kg 3种植物生长调节剂混标提取液未净化色谱图Fig.2 Chromatogram of pear spiked with three plant growth regulators(2.0
mg/kg)non-purified
图3 鸭梨添加0.4 mg/kg混标提取液C18固相萃取净化色谱图Fig.3 Chromatogram of pear spiked with three plant growth regulators(0.4
mg/kg)purified by C18column
2.4 线性范围、检出限的测定
将含有3种植物生长调节剂目标化合物的混合标准溶液加入到样品中，在最佳提取和色谱条件下，检测系列不同浓度(0.5、1.0、2.0、5.0、10 μg/mL)样品。

按1.2.3色谱条件测定峰面积，以峰面积为纵坐标(y)，标准品溶液的质量浓度为横坐标(ρ，μg/mL)，绘制标准曲线，得到线性回归方程。

以信噪比(S/N)分别为3和10时实验方法所能检出和定量的目标化合物的最低浓度定义为各化合物的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)，结果见表2。

3种植物生长调节剂在0.5～10 μg/mL内呈良好的线性关系，相关系数(r)均大于0.999，测得赤霉素、多效唑和烯效唑的检出限分别为0.002、0.04、0.02 mg/kg，定量下限分别为0.006 7、0.133、0.067 mg/kg。

表2 三种植物生长调节剂的线性范围、回归方程、相关系数、检出限及定量下限
Table 2 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients(r)，limits of detection(LOD)and limits of quantitation(LOQ)of three plant growth regulators分析物线性范围/(μg·mL-1) 回归方程相关系数(r) 检出限LOD/(mg·kg-1)定量下限(LOQ)/(mg·kg-1)赤霉素 0.5～10 y=50.06ρ+0.008 0.999 84 0.002 0.0067多效唑 0.5～10 y=82.99ρ-0.599 0.999 75 0.04
0.133烯效唑 0.5～10 y=77.45ρ-0.188 0.999 89 0.02 0.067
表3 水果中赤霉素、多效唑、烯效唑加标回收率及相对标准偏差(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of three plant growth regulators分析物标准加入量/(mg·kg-1)苹果回收率/%相对标准偏差/%鸭梨回收率/%相对标准偏差/%赤
霉素0.2 0.4 0.8 81 83 87 4.0 2.9 2.7 83 89 90 3.8 2.5 3.1多效唑0.2 0.4 0.8 78 82 85 5.4 2.8 2.6 79 84 89 4.2 2.8 3.0烯效唑0.2 0.4 0.8 80 82 89 4.1 3.9 2.4 82 85 91 3.3 4.2 2.9
2.5 回收率与精密度试验
采用添加回收的方法，对苹果和鸭梨空白样品添加0.2、0.4、0.8 mg/kg 3种植
物生长调节剂混合标准品，按照1.2.2方法处理后测定样品峰面积，用标准对照法进行定量，计算3种植物生长调节剂的回收率和相对标准偏差(见表3和图4)。

结果表明，3种植物生长调节剂的平均回收率为78% ～91%，RSD均不高于5.4。

3 结论
本研究对于水果中赤霉素、多效唑和烯效唑多残留检测主要着力于简单、快速的样品前处理和色谱分析方法2个方面。

该方法具有操作简便，净化效果好，回收率、精密度和灵敏度较高的特点，适用于水果中赤霉素、多效唑和烯效唑多残留分析检测，易于在我国基层检测机构和企业推广应用。

参考文献
［1］郭潇，赵文.植物生长调节剂的安全性分析［C］.2007中国农业工程学会农
产品加工及贮藏工程分会学术年会暨中国中部地区农产品加工产学研研讨会论文集，北京:中国农业工程学会，2007:233-236.
［2］葛志荣.主要贸易国家和地区食品中农兽药残留限量标准(农兽药卷)［M］.
北京:中国标准出版社，2004.
［3］林维宣.各国食品中农药兽药残留限量规定［M］.大连:大连海事大学出版社，2002.
［4］张慧，吴颖，路勇，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定苹果中的赤霉素、脱落酸、甲萘威、多效唑和烯效唑的残留量［J］.食品工业科技，2010，
31(10):383-385.
［5］王静静，鹿毅，杨涛，等.HPLC-MS/MS法同时测定果蔬中6中植物生长抑制剂残留［J］.分析测试学报，2011，30(2):128-134.
［6］曹慧，陈小珍，王瑾，等.超高效液相色谱-串联质谱技术同时分析食品中多种植物激素残留［J］.农药，2012，51(10):738-741.
［7］周艳明，汤媛，牛森.高效液相色谱法检测草莓中赤霉素残留量的研究［J］.食品工业科技，2009，30(1):311-312.
［8］黄红林，刘实，张桃芝.固相萃取-高效液相色谱测定番茄中的赤霉素 GA3
残留［J］.分析科学学报，2005，21(1):75-77.
［9］葛雅琨，张元新，胡睿，等.蔬菜中赤霉素残留量的高效液相色谱检测方法
研究［J］.吉林化工学院学报，2005，22(2):13-16.
［10］史晓梅.多效唑等5种植物生长调节检测技术及多效唑在桃上的残留研究［D］.北京:中国农业科学院，2012.
［11］张元新.高效液相色谱检测赤霉素残留量的方法优化［D］.长春:东北师范
大学，2008.
［12］ Parvathamma T A，Ramesh，Nageswara R T.Determination of
paclobutrazol residue in mango fruit using a matrix solid-phase dispersion method coupled to High-Performance liqiud chromatographu with ultraviolet detection［J］.International Journal of Chem Tech Research，2012，4(4):1 473-1 477.
［13］邓海滨，王晓容，潘学文，等.烯效唑的高效液相色谱(HPLC)分析［J］.仲恺农业技术学院学报，2003，16(3):33-37.
［14］陈巧云，赵华，陈兵，等.烯效唑反相高效液相色谱法测定［J］.浙江农业科学，2003(4):210-211.。