(武汉大学)分子18.原核生物的转录调控

（武汉大学）分子18.※原核生物的转录调控
●本章概要
●不同基因启动子的强度不同，基因表达水平不同
●受调控的基因（管家基因与组织特异性基因）
●持家基因
所有细胞中均要表达的一类基因
●控制细胞基本生命过程
●可诱导基因
当被诱导物或细胞因子激活时表达
●常常由胞外信号的改变而表达
●基因调控在转录起始时最为常见
●转录调控的原理
●调控蛋白
DNA结合蛋白，识别受其控制的基因上或基因附近的特异位点
●activator 活化子（正调控蛋白）
增强基因转录
●repressor 抑制子（负调控蛋白）
降低或关闭基因转录
●一般在转录起始作用的原因
●在起始阶段抑制能够避免能量和资源的浪费
●比起翻译起始（调控数个mRNA），转录起始（调控一个启动子）更容易
调控
●在转录起始之外阶段调控的优势
●可以有更多信号参与调控，具有更多检查点
●对信号有更快的反应
●recruitment 募集调控
靶点——RNA聚合酶与启动子结合
●basal level 本底水平表达
组成型低水平表达
●通常情况下RNA聚合酶微弱地结合在启动子上
●activator 活化子
同时结合DNA和RNA聚合酶，增加两者间的亲和力
●有两个结合位点：DNA和RNA聚合酶
●增加转录水平
●repressor 抑制子
结合到DNA与RNA聚合酶结合区相重叠的位点
●阻止RNA聚合酶的结合，从而抑制或阻止转录
●operator 操作子（注意区别operon 操纵子）
DNA上抑制子结合的位点
●allostery 变构调控
靶点——从closed complex向open complex的转变
●activator 活化子
closed complex: 聚合酶与启动子结合，DNA保持双链状态 open complex: 在起始位点周围约14bp处解链形成转录泡
●使RNA聚合酶从closed complex转变为open complex，继而开始转录
●repressor 抑制子
●抑制闭合式到开放式复合物的转变
●抑制启动子逃离
●远程激活和DNA环化
●DNA结合蛋白互作
调控蛋白可以结合在离启动子区较远的位点并发挥作用
●DNA-弯曲蛋白
协助弯曲DNA
●转录起始外的调控
●其他调控点
●转录的延伸和终止
●核糖体蛋白基因的翻译
●由RNA进行的转录和翻译的调控
●attenuation 衰减作用
●核糖开关
●小干扰RNA
●原核生物转录调控实例
●乳糖操纵子 (lac operon) [recruitment 募集调控]
细菌利用乳糖作为碳源时需要lacZYA编码的酶
●启动子结构组成
●3个结构基因
受一个启动子P_{lac}调控，转录为一条lacZYA mRNA
●lacZ
●编码β-半乳糖苷酶
将乳糖切割成半乳糖和葡萄糖
●lacY
●编码乳糖渗透酶
插入细胞膜，将乳糖转运到细胞内
●lacA
●编码硫代半乳糖苷乙酰转移酶
消除lacY转入的硫代半乳糖，防止毒伤细胞
●2个控制元件
●CAP site
●结合活化子CAP (cAMP receptor protein, CRP)
●招募RNA聚合酶指导转录起始
●启动子P_{lac}的-35区缺乏UP-element，不适合RNA聚合酶结合
暗示了活化子结合位点的存在
●O_{lac} (lac operator)
●结合lac 抑制子
●抑制RNA聚合酶的结合
●O_{lac}与P_{lac}有重叠，阻止RNA聚合酶与启动子结合
●发生机制
CAP和抑制子的联合作用保证在乳糖存在且缺少葡萄糖的环境中，lac基因得以显著表达
●同时存在葡萄糖和乳糖时，优先使用葡萄糖，lac基因低水平转录
●抑制子感应乳糖信号
●当乳糖含量低时，抑制子激活，lac基因不转录
●活化子CAP感应葡萄糖信号
与RNA聚合酶的αCTD直接相互作用（αCTD：原结合UP-element的位点）｜帮助RNA聚合酶与P_{lac}结合和稳定
●当葡萄糖含量低时，活化子激活，lac基因高水平转录
●信号控制
二级信号：异乳糖 / cAMP
●异乳糖← lactose乳糖
由β-半乳糖苷酶介导转变为异乳糖，能关闭抑制子，抑制其与O_{lac}的结
合
●乳糖水平低，异乳糖水平低，大部分lacZYA被抑制子抑制
●乳糖水平高，（细胞内原有的）乳糖渗透酶吸收乳糖转变为异乳糖，与
抑制子结合使其失活，lacZYA得到转录
●cAMP← glucose葡萄糖
降低cAMP浓度，抑制CAP-cAMP与CAP site的结合
●葡萄糖水平低，cAMP浓度高，CAP-cAMP可以与lacZYA结合并转录
●葡萄糖水平高，cAMP浓度低，CAP缺少cAMP而无法与lacZYA结合●不同的σ factor
不同的σ因子结合RNA聚合酶，与不同的启动子亲和力增强，从而转录不同的启动子
●σ^{70}——最常见的σ factor
●热休克σ^{32}（heat shock 热休克反应）
●当环境温度>37℃，参与转录蛋白质
●有其特有的启动子共有序列
●感染B. subtilis的噬菌体SPO1的级联表达
上一时期基因的转录产物中包含这一时期所需的σ factor
●两个活化子NtrC和MerR[allostery 变构调控]
●NtrC——参与控制氮(N)代谢的基因表达
●具有ATPase活性
为诱导聚合酶产生构象变化而提供能量
●作用于离基因较远处
●具有独立的激活域和DNA结合域，只有在低氮时与DNA结合，使RNA聚
合酶由closed complex向open complex转变
低氮水平（信号）→ NtrC磷酸化发生构象改变→ 暴露NtrC的DNA结合区，发生结合→ NtrC与σ^{54}直接相互作用→ 激活NtrC的ATPase活性，为RNA聚合酶构象改变提供能量→ 转录起始
●MerR——控制merT基因编码抗汞(Hg)酶
●通过改变DNA构象激活merT的表达
●Hg离子不存在
MerR结合启动子，但其构象不利于转录（-35元件与-10元件间的距离是
19bp）
●Hg离子存在
MerR-Hg^{2+}构象改变→ 启动子中心扭曲→ -35与-10 元件间距缩短
（易于σ^{70}结合）→ 转录起始
●抑制作用的其他变构机制
●E.coli Gal抑制子
抑制closed complex向open complex的转变
●噬菌体Φ29的P_4蛋白
抑制启动子的逃离（在不同启动子中作用不同）
●结合强启动子P_{A2c}——抑制
聚合酶和启动子之间的强相互作用加上活化子相互作用所提供的总结合
能太强，将聚合酶固定在启动子上无法移动
●结合弱启动子P_{A3}——激活
活化子的额外结合能协助招募聚合酶
●阿拉伯糖操纵子 (araBAD operon)
●启动子在有阿拉伯糖而没有葡萄糖时启动激活转录，编码代谢阿拉伯糖所需的
酶（类似于lac operon）
●两个活化子
●AraC
●有阿拉伯糖时
阿拉伯糖结合AraC，AraC结合araI_1和araI_2位点，I_2位点上的AraC
激活RNA聚合酶起始转录
●无阿拉伯糖时
AraC结合araI_1和araO_2位点而发生DNA环化，araI_2位点未被激活，
转录不能起始
●CAP
在无葡萄糖时结合到CAP site协助转录
●阿拉伯糖转录启动子常被用作expression vector 表达载体
●阿拉伯糖诱导araBAD启动子的数量级非常大
●阿拉伯糖对araBAD启动子的控制力很强
●λ噬菌体的调控
●基因组结构
●50Kb，含有61个基因
●启动子
●强启动子：P_R, P_L（P_R：向右转录，P_L：向左转录）
●弱启动子：P_{RM} (Repressor Maintance), P_{RE} (Repressor Establishment)
●两种生长模式
●lytic growth 裂解生长
●噬菌体DNA的复制
●新外壳蛋白的合成
●通过宿主细胞裂解释放
●lysogenic growth 溶原生长
●噬菌体DNA整合进入细菌染色体
●在每次细胞分裂的时候主动复制
●非常稳定
●lysogenic induction 溶原性诱导——从溶原生长到裂解生长的转变
●生长模式的维持机制
由不同的启动子和调控蛋白决定
●cro(control of repressor and other thing)（启动裂解生长）
抑制转录
●由P_R起始转录
单个Cro二聚体结合O_{R3}（占据了弱启动子P_{RM}的位点）→ 强启动
子P_R自身进行Cro的转录→ 不断产生Cro蛋白强化过程进行
●cⅠ→λ repressor（启动溶原生长）
既可以激活也可以抑制转录
●正自我调控
●由P_{RM}起始转录
cⅠ所编码产生的λ repressor二聚化后于O_{R1}结合→ 四聚化使之与O_{R2}
结合（占据了强启动子P_R的位点）→ O_{R2}上的λ repressor作为活化
子招募RNA聚合酶→ 激活P_{RM}的转录进而转录cⅠ不断产生λ repressor ●生长模式的建立——cⅡ蛋白
●裂解生长——通过P_R启动
●P_R是强启动子，一旦感染发生，它就启动转录，产生cro蛋白
●cro蛋白水平达到一定量时结合O_{R3}，关闭P_{RM}（导致溶原生长无法
进行）
●溶原生长——通过P_{RM}启动
为建立溶原生长，cⅡ 必须在cro抑制P_{RM}前激活之由P_{RE}建立，由P_{RM}维持
●P_R转录的产物除了cro外还有cⅡ
●cⅡ结合DNA，激活启动子P_{RE}，产生cⅠ蛋白
●当cⅠ达到一定量时结合在O_{R1}和O_{R2}上，启动P_{RM}的转录
●cⅡ 稳定性受E. coli生长条件控制——FtsH 蛋白
cⅡ在E. coli中不稳定，被蛋白酶FtsH降解
●E. coli生长条件良好
●FtsH活性高→ cⅡ被其降解→ 发生裂解生长
●E. coli生长条件恶劣
●FtsH活性低→ cⅡ积累→ 发生溶原生长
●本章名词
●转录调控的原理
●activator
●repressor
●basal level (contitutive expression)
●operator
●recruitment
●allostery
●原核生物转录调控实例
●Lac repressor
●lac operator
●lactose
●glucose
●expression vector
●λ噬菌体的调控
●lytically
●lysogenically
●lysogenic induction
●重点知识点
●什么是调控蛋白？什么是受调控基因？转录调控的原理是什么？
调控蛋白可分为两类：正调控蛋白或活化子、负调控蛋白或抑制子。

这些调控蛋白通常都是DNA结合蛋白，它们识别受其控制的基因上的或附近的特异位点。

活化子增强受控基因的转录，抑制子降低或消除相应基因的转录。

受调控的基因也可分为两类：持家基因（housekeeping gene）：指参与细胞生长和复制等必须的基本生命过程的基因，在细胞中组成型表达；可诱导基因（inducible gene）：只有受到诱导物或细胞因子激活时才表达的基因。

转录调控的原理：
●在转录起始过程中，调控蛋白的作用机制有哪些？（转录起始调控的作用机制）
（什么是operator 操作子？）
本底水平（base level）表达：当聚合酶结合启动子时，它会自动经由闭合式复合体向开放式复合体转变而启动转录，这最后导致基因的组成型表达。

调控蛋白可以通过募集调控（recruitment）和变构调控（allostery）来控制转录。

①在募集调控中，活化子以其一个表面结合到启动子附近的某一DNA位点，另一表面与RNA 聚合酶相互作用，将聚合酶带到启动子。

抑制子结合到称为操作子（operator）的与聚合酶结合区相重叠的位点上，阻碍聚合酶与启动子的结合从而阻止转录。

②在变构调控中，活化子与闭合式复合物结合，诱导RNA聚合酶或DNA启动子的构象变化，使闭合式复合物转变为开放式复合物。

抑制子则抑制RNA聚合酶从闭合式复合物向开放式复合物的转变，并抑制启动子逃离。

值得一提的是，常有两个或多个活化子（或抑制子）间彼此互作并与DNA相互作用，彼此协助结合到所调控的基因附近，说明有些基因的激活需要多种信号的存在。

●什么是操纵子？简述其结构和功能。

操纵子（operon）是原核生物基因表达和调控的单位，它通常由3个部分组成：①结构基因：编码与某一代谢过程相关的酶类，这些基因的表达受到协同控制；②控制元件：与调控蛋白结合，参与结构基因表达控制的序列；③调节子基因（regulator gene）：编码与调控原件结合的蛋白质。

●乳糖操纵子的结构、控制机制，有哪些信号或二级信号控制乳糖操纵子的表达？
乳糖操纵子是细菌参与乳糖代谢的一个基因群，其启动子由3个结构基因和2个控
制元件组成。

（1）三个结构基因：①lacZ：编码β-半乳糖苷酶，负责将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖；②lacY：编码乳糖渗透酶，负责将乳糖从胞外转运到细胞内；
③lacA：编码硫代半乳糖苷乙酰转移酶，负责消除被lacY转入的硫代半乳糖苷对细胞的毒性。

lacZYA基因在共同启动子P_{lac}的控制下转录为一条多顺反子mRNA。

（2）两个控制元件：①CAP位点：结合活化子CAP以招募RNA聚合酶指导转录起始，由于P_{lac}是弱启动子，且不存在UP元件，所以需要CAP的招募；②O_{lac}（乳糖操作子）：与P_{lac}序列有部分重叠，结合抑制子从而阻止RNA聚合酶的结合。

控制机制：①当环境中同时存在葡萄糖和乳糖时，细胞优先使用葡萄糖，lac基因本底水平转录。

②当乳糖含量低时，抑制子与操作子结合，RNA聚合酶无法与DNA结合，lac基因不转录；③当葡萄糖含量低时，活化子结合在CAP位点，与RNA聚合酶的αCTD尾直接相互作用，lac基因高水平转录。

在乳糖操纵子中还有二级信号的存在，对应葡萄糖和乳糖分别是cAMP和异乳糖（allolactose）。

①当葡萄糖水平低时，cAMP浓度高，CAP-cAMP可以与lacZYA 结合并转录；葡萄糖水平高时，cAMP浓度低，CAP缺少cAMP而无法与lacZYA 结合；②当乳糖水平低时，异乳糖水平低，大部分lacZYA转录被抑制；乳糖水平高时，乳糖渗透酶吸收乳糖转变为异乳糖，进而与抑制子结合使其失活，lacZYA 转录。

●不同的σ因子对基因转录有何影响？举例说明。

不同的σ因子结合同一种RNA聚合酶，从而RNA聚合酶就可以与不同的启动子结合，从而转录出不同的蛋白质产物。

σ因子决定了RNA聚合酶与启动子的结合特异性。

在细菌中可产生一系列σ因子，当环境温度达37℃时，细菌发生热休克反应（heat shock），热休克σ^{32}与RNA聚合酶结合，识别这些热休克蛋白的启动子。

在噬菌体SPO1中，σ因子介导转录产物的级联表达。

●简述NtrC和MerR的变构调控机制。

NtrC是参与氮代谢基因表达的调控蛋白，它具有ATPase活性，利用变构作用促使开放式复合物的形成。

当氮浓度很低时，激酶NtrB磷酸化NtrC，使其构象发生变化，暴露NtrC的DNA结合域并与σ^{54}结合，水解ATP为RNA聚合酶构象改变提供能量，进而激活转录。

MerR控制汞抗性相关基因的表达，通过改变DNA 构象进而激活启动子的表达。

当环境中无汞时，MerR与merT启动子-10~-35间的一段DNA结合，此时聚合酶能与启动子结合但无法起始转录。

当有汞离子存在时，汞与MerR结合使其构象发生变化，所结合的DNA发生扭曲，-10~-35形成强启动子结构，聚合酶可以起始merT的表达。

●在原核生物转录调控中，有哪些除NtrC和MerR的其他变构机制？
①E.coli Gal抑制子结合位点位于启动子旁边，通过与启动子上的RNA聚合酶相互作用而阻止闭合式复合物向开放式复合物的转变②噬菌体φ29的P_4蛋白结合弱启动子P_{A3}时，激活基因起始转录；而结合强启动子P_{A2c}时，额外的相互作用力导致总结合能太强，将聚合酶固定在启动子上无法移动
●阿拉伯糖操纵子（araBAD operon）的结构和激活机制
阿拉伯糖操纵子的启动子在有阿拉伯糖而没有葡萄糖时启动激活转录，编码代谢阿拉伯糖所需的酶。

有两个活化子起作用：①AraC：在无阿拉伯糖时，AraC结合araI_1和araO_2位点而发生DNA环化，araI_2位点未被激活，转录不能起始；在有阿拉伯糖时，阿拉伯糖结合AraC，AraC结合araI_1和araI_2位点，I_2位点上
的AraC激活RNA聚合酶起始转录。

②CAP：在无葡萄糖时结合到CAP位点协助转录。

阿拉伯糖转录启动子的诱导活化非常强大，因此araBAD启动子常被应用于表达载体，即将外源基因克隆在该启动子后，当受到阿拉伯糖的诱导时，启动外源基因的高效表达。

●λ噬菌体的调控相关知识点
●什么是λ噬菌体？怎样理解它的裂解生长和溶原生长现象？（溶原性诱导）
λ噬菌体是一种感染E. coli 的病毒。

它一旦感染细菌，就会以两种方式繁殖：裂解（lytically）或溶原生长（lysogenically）。

①裂解生长需要噬菌体DNA 的复制和新的外壳蛋白的合成，这些组分共同形成新的噬菌体颗粒，通过宿主细胞的裂解释放出来；②溶原生长是一种选择性繁殖途径，噬菌体DNA整合进入细菌染色体并像细菌基因组的正常组分一样在每次细胞分裂的时候主动复制。

溶原性细菌在正常情况下非常稳定，但其体内处于静止的噬菌体在细胞DNA遭受破坏时就会转向裂解生长，进而威胁到宿主细胞的生存。

这种从溶原生长到裂解生长的转变称为溶原性诱导（lysogenic induction）。

●λ噬菌体如何维持在宿主中的裂解或溶原生长？溶原性诱导如何发生？（正自
我调控、负自我调控的例子）
解释什么是λ噬菌体、裂解生长、溶原生长。

噬菌体的启动子区域包括2个基因（cⅠ和cro）和3个启动子（P_R、P_L、P_{RM}）。

其中cⅠ基因编码λ抑制子，它既可以激活也可以抑制转录；cro基因产物只抑制转录；P_R、P_L是强启动子，能有效结合RNA聚合酶，不需要活化子来指导转录；P_{RM}是弱启动子，只有结合活化子后才能指导转录。

cⅠ和cro编码的λ抑制子和cro蛋白的共同作用维持噬菌体在宿主中的裂解或溶原生长。

①在裂解生长中，P_R、P_L 开放，强启动子P_R转录cro，单个cro二聚体结合O_{R3}，占据了弱启动子P_{RM}的位点，从而抑制溶原生长；②在溶原生长中，P_{RM}开放，cⅠ编码的λ抑制子协同结合到O_{R1}和O_{R2}阻碍RNA聚合酶结合P_{R}，抑制裂解生长λ抑制子作为活化子还可激活P_{RM}开始的转录。

溶原性诱导需要λ抑制子的蛋白水解切割。

在进行溶原性诱导时，λ抑制子构象改变成类似细菌中的LexA，这时细菌中的RecA刺激λ抑制子进行自我切割，最终λ抑制子无法结合O_{R1}和O_{R2}，导致裂解生长。

λ抑制子的水平还受到严密的正自我调控（positive autoregulation）和负自我调控（negative autoregulation）。

正自我调控指λ抑制子作为活化子可以激活自身转录；负自我调控指在λ抑制子浓度过高时，它会结合O_{R3}而抑制P_{RM}，进而抑制自身转录，直到浓度降到释放O_{R3}的水平。

●λ噬菌体在侵染细菌后如何建立裂解或溶原生长？这与生长环境有何关系？
在λ抑制子调控区之外还存在基因cⅡ，它的表达产物可以结合启动子P_{RE}的上游位点，进而刺激cⅠ的转录。

①裂解生长的建立：强启动子P_R转录cro，单个cro二聚体结合O_{R3}，占据了弱启动子P_{RM}的位点，从而抑制溶原生长；②溶原生长的建立：P_R转录的基因除了cro外还有cⅡ，cⅡ产物激活启动子P_{RE}，产生cⅠ蛋白，cⅠ达到一定量时结合在O_{R1}和O_{R2}上，启动P_{RM}的转录。

裂解生长建立时会同时产生基因cⅡ的产物，产物的稳定性受
E. coli中的FtsH蛋白控制，而这种蛋白的活性受生长环境影响。

当生长条件良
好时，FtsH活性高，cⅡ产物降解，发生裂解生长；当生长条件恶劣时，FtsH活
性低，cⅡ产物积累，发生溶原生长；。