磁性聚合物微球的制备及其在酶法拆分氨基酸中的应用

１．４．２载体结合法
该法是将酶结合于水不溶性载体的一种固定化方法，载体可分为有机载体和无机载体两大类。

有机载体的表面有许多活性基团，如一ＯＨ、一ＮＨ２、一ＣＯＯＨ等，因此被认为是比较好的固定化载体。

无机材料中含有各种氧化物，具有很高的热稳定性和很好的流动性。

１．４．３交联法
交联法是通过双功能或多功能基试剂使酶分子间或酶分子与载体之间或酶分子与惰性蛋白之间发生交联而形成网状结构的固定化方法。

此法与共价结合法一样，也是利用共价键固定化酶，所不同的是它不使用载体。

交联剂有很多种，最常用的是戊二醛，其它有异氰酸衍生物、双氮联苯等。

交联法反应条件比较剧烈，酶活回收率一般比较低。

１．４．４包埋法
包埋法可分为网格型和微囊型两种。

该法一般无需与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，较少改变酶的高级结构，酶活回收率较高。

包埋固定化法是把酶定位于聚合物材料的格子结构或微胶囊结构中。

这样可以防止酶蛋白释放，但是底物仍能渗入格子内与酶相互接触。

此法比较简便，酶分子仅仅是被包埋起来，生物活性破坏少，但此法对大分子底物不适用。

包埋法交联法
吸附法共价法
图１－２固定化方法示意图
Ｆｉｇ．１－２Ｓｋｅｔｃｈｍａｐｏｆｔｈｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ
不同的固定化方法，因它们的固定化机理不同，固定化的难易程度和效果也大不相同，影响固定化酶效果的两个重要因素是固定化方法和固定化载体。

１．５磁性载体
磁性高分子微球具有高分子微球的特性，可通过共聚、表面改性赋予其表面多种反应性基团，如一ＣＯＯＨ，－－ＮＨ２，一ＯＨ，一ＣＯＨ等【ｉ¨，与生物活性物质的交联吸附能力大。

而且，磁性高分子微球具有良好的机械强度和化学稳定性。

具有能够抵抗机械摩擦，酸碱腐蚀和微生物降解的优势。

同时，又因微球内部含有磁性粒子，具有超顺磁性，可在外加磁场的作用下快速运动。

因而，在生物医学、细胞学、生物工程和环境保护等领域有着广泛的应用前景。

１．５．１细胞分离与标记
磁性载体分离细胞【控］的原理主要是基于抗体一抗原之间的亲和作用，即将抗体固定在磁性Ｆｅ３０４载体表面形成免疫磁珠（ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄｓ），它可以和目标细胞表面的抗原特异性结合，在外磁场作用下将细胞分离【Ｉ３１。

通过选择不同表面特异性抗体，既可以用于分离不需要的细胞（反向分离），也可用于富集所需要的细胞（正相分离）。

康继超［¨】等用物理吸附和化学键共价结合的方法，将抗人膀胱癌单克隆抗体连接到预先制备的聚苯乙烯磁性微球表面，构建了能特异地与靶细胞结合并赋予其磁响应性的免疫磁性微球（Ｉｍｍｕｎｏｍａｇｅｔｉｃｍｉｅｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，ＩＭＭＳ），用于从骨髓中分离癌细胞。

实验证明，所构建的ＩＭＭＳ可有效地和靶细胞结合。

用ＩＭＭＳ从动物骨髓中分离癌细胞的初步实验表明，ＩＭＭＳ可有效清除癌细胞，而骨髓细胞仅有很少量的损失。

１．５．２固定化酶
图１－３固定化方法示意图
Ｆｉｇ．１－３Ｓｋｅｔｃｈｍａｐｏｆｔｈｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ
酶是一种生物蛋白质，目前常用的酶分离方法存在的问题是酶在分离后很容易失活，影响到它的催化活性。

用磁性微球分离酶可以很好地保持它的活性和稳定性，同时也使得体系中酶的回收更加方便，提高了酶的使用效率［１Ｓ－２０］。

国内邱广明［２１】等采用碳化二亚胺法在磁性微球表面固定中性蛋白酶，制备活性高达７００ｔ缓冲溶液ｐＨ６．０、离子强度较高时，固定化酶的活性最高。

一般来说，和游离酶相比，固定化酶的活性会有所降低，但稳定性显著增强。

１．５．３免疫分析
将磁性微球表面包被特异性抗体，就可以和待测样品中抗原发生免疫反应，用磁铁就可以将微球和样品基质分离，然后将吸附抗体和抗原的磁性微球用荧光免疫检测法或电化学发光检测法检测【２２矗３１。

该过程使免疫分离与富集结合为一体，提高了分析检测的灵敏度，同时避免了分析过程对人可能的危害。

１．５．４靶向药物
磁性靶向药物是将靶抗体通过共价交联或吸附结合到磁性颗粒药物载体上，通过静脉注射到动物体内，在足够强的外磁场作用下，通过纳米微粒的磁性导航以及特异性抗体的靶向作用，使其移向病变部位，其所含的药物（或放射性药物）定位释放，集中在病变部位发挥作用ｆ２４－”１．由于所包裹的纳米磁粉具有超顺磁性，它可通过外磁场的作用进行快速富集，而当外磁场消失后，又可以消磁，被重新分散，从而避免了因刚性微球聚集而阻塞血管导致的严重后果。

ＵｒｓＨａＫｆｃｌｉｔ２８】在磁性微球上标定量一放射铼（Ｒｅ）．１８８，磁性载体是由金属铁和活性炭组成。

由于磁性载体（ＭＴＣ）能有效靶向到肿瘤部位，所以Ｒｅ－ＭＴＣ能集中对肿瘤部位辐射治疗，减小了对周围组织和器官的辐射。

图Ｉ－４靶向药物系统作用示意图‘２９１
Ｆｉｇ１－４Ｔａｒｇｅｔｅｄｄｒｕｇｄｅｌｉｖｅｒｙｓｙｓｔｅｍ：ｕｓｉｎｇｍａｇｎｅｔｉｃｆｉｅｌｄｔｏｄｒｕｇａｔｃａｎｃｅｒｏｒｔｕｍｏｒｓｉｔｅ１．５．５环境保护
鉴于磁性微球强大的功能特点以及在生化领域的成功应用，科研工作者已经尝试将磁性微球引入环境监测领域，用于对环境中自然水体、工业废水、生活污水、土壤环境中部分有毒有机物、病毒、细菌的检测。

此外，将磁性微球应用于环境污染处理，如废水处理，将是环境治理中另一个崭新的领域‘３０】。

图３．４硅烷化的Ｆｅ３０４粒子ＳＥＭ图片
Ｆｉｇ．３－４ＳＥＭｉｍａｇｅｓｏｆＦｅ３０４ｐａｒｔｉｃｌｅｓｍｏｄｉｆｉｅｄｂｙｓｉｌｉａｒｔｅ３．４．４透射电镜（ＴＥＭ）分析
图３－５硅烷化的Ｆｅ３０４粒子ＴＥＭ图片
ＴＥＭｉｍａｇｅｓｏｆＦｅ３０４ｐａｒｔｉｃｌｅｓｍｏｄｉｆｉｅｄｂｙｓｉｌｉａｎｅＦｉｇ．３—５
（３）加热下水分蒸发，硅醇进行醚化反应，脱水
（４）硅醇与Ｆｅ３０４纳米粒子表面进行醚化反应
下图为总的反应示意图
图３－６修饰的原理
ｒｉｇ３－６Ｔｈｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｏｆｍｏｄｉｆｙｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎ
４．３．１熔点分析
有机物的熔点通常用毛细管法来测定，实际上由此法测得的不是一个温度点，而是熔化范围‘４们。

纯粹的固态物质通常都有固定的熔点（熔化范围约在Ｏ．５℃以内），如有其他物质混入，则对其熔点有显著影响，不但使熔化温度的范围增大，而且往往使熔点降低。

因此，熔点的测定常常可以用来识别物质和定性地检验物质的纯度。

４．３．２旋光度分析
测定旋光度，进而求出物质的比旋光度，这是手性化合物研究的重要方法·通过旋光度和比旋光度我们可以知道手性有机物的纯度。

实验中使用的是ＷＸＧ．４圆盘旋光仪先按规定的浓度配制好溶液，依法测出旋光度，然后按下列公式计算比旋光度：［ａ］Ｄ＝ａ／ＬＣ，式中ａ为测得的旋光度（度），Ｃ为溶液的浓度（克／１００毫升），Ｌ为溶液的长度即试管长度（分米）
４．３．３透射电镜分析
用适量无水乙醇稀释样品滴到镀有碳膜的铜网上待水溶剂挥发后进行ＴＥＭ观察图。

采用交联法制备的固定化酶的透射电镜中明显可以看到中间黑色的磁性核心部分，周围有絮状的物质包裹着，微球的单个形体基本上都是球形的，大小也很均匀，但是分散性不好，这也证实了，交联剂的作用所在。

图４．３交联法固定化酶ＴＥＭ
Ｆｉｇ４－３ＴＥＭｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｅｎｚｙｍｅｂｙＣＲＯＳＳ—ｌｉｎｋｅｄｍｅｔｈｏｄ
３３
图４－４吸附法固定化酶ＴＥＭ
Ｆｉｇ４－４ＴＥＭｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｅｎｚｙｍｅｂｙａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ
用琼脂糖包覆的磁性微球为载体的固定化酶透射电镜结果表明，中间的磁性核心部分基本上呈现方形，粒径较小，可能是由于在合成磁性颗粒的反应过程加入了琼脂糖，从而在合成过程中阻止了磁性颗粒的进一步团聚。

４．３．４红外光谱分析
图４－５琼脂糖包覆的磁性Ｆ。

３０４粒子的ＦＴ－ＩＲ光谱图
Ｆｉｇ．４·５ＦＴ－ＩＲｓｐｅｃｔｒｕｍｏｆａｇａｒｏｓｅ—ｍｏｄｉｆｉｅｄｍａｇｎｅｔｉｔｅｐａｒｔｉｃｌｅｓ
琼脂糖包覆的磁性Ｆｅ３０４经真空冷冻干燥后用ＫＢｒ压片法进行铡定所用仪器为傅立叶红外光谱仪（ＮｉｃｏｌｅｔＦＴＩＲ２００，美国ＰＥ公司）。