tet2和dnmt3a在外周t细胞淋巴瘤中的表达及其意义

Expression and clinical significance of TET2 and DNMT3A
in peripheral T cell lymphoma
Abstract
Objective To investigate the expression and clinical and pathological significance of TET2 and DNMT3A in patients with peripheral T cell lymphoma (PTCL) and the relationship to immunophenotypes of PTCL.
Methods 1. Using a series of immunohistochemical markers (CD3, CD4, CD10, BCL-6, CXCL-13, CD30, EMA, ALK), all cases of PTCLs were divided into four groups, including angioimmunoblastic T cell lymphoma (AITL), peripheral T cell lymphoma, not otherwise specified (PTCL-NOS), anaplastic lymphoma kinase negative anaplastic large cell lymphoma (ALK-ALCL) and anaplastic lymphoma kinase positive anaplastic large cell lymphoma (ALK+ALCL). 2. The expressions of TET2 and DNMT3A in 89 cases of PTCL were detected by immunohistochemical analysis.
Results 1. 89 cases were divide into four subtype, AITL (36 cases, 40.44%), PTCL-NOS (26 cases, 29.21%), ALK-ALCL (18 cases, 20.22%), ALK+ALCL (9 cases, 10.11%). 2. Both TET2 and DNMT3A were expressed in cytoplasm and nucleus in PTCL cases. 3. Immunohistochemistry staining revealed higher expression of TET2 and DNMT3A in AITL than that of in PTCL-NOS (P=0.001, P=0.048), ALCL (P=0.001, P=0.001). 4. Immunohistochemistry staining revealed higher cytoplasmic expression of TET2 in AITL than that of in PTCL-NOS (P=0.001), ALCL (P<0.001). There also was a higher cytoplasmic expression of DNMT3A in AITL patients than that with PTCL-NOS (P=0.029), ALCL (P=0.024). 5. The nuclear expression of DNMT3A in patients with AITL was higher than that of PTCL-NOS (P=0.047), and ALCL (P<0.001). 6. The expression of TET2 was positively related with that of DNMT3A in patients with PTCL (r=0.384, P<0.001). The cytoplasmic expression of TET2 was positively related with both cytoplasmic (r=0.350, P=0.001) and nuclear (r=0.365, P<0.001) expression of DNMT3A in patients with PTCL. 7. The expression of TET2 was positively related with that of DNMT3A in patients with AITL (r=0.478, P=0.003). The cytoplasmic expression of TET2 was positive related with both cytoplasmic (r=0.336, P=0.045) and nuclear (r=0.478, P=0.003) expression of DNMT3A in patients with AITL.8. The high nuclear expression rate of TET2 in PTCL patients with B symptoms was higher than that in patients without B symptom, the difference was statistically significant (P= 0.003). In patients with stage III + IV, the high cytoplasmic expression rate of TET2 was higher than stage I + II patients, the difference was not statistically significant, but at the critical level (P = 0.061). 9. The expression of TET2 and DNMT3A was not associated with age, sex, LDH level and IPI score and extranodal infiltration in patients with PTCL.
Conclusion TET2 and DNMT3A may be involved in lymphomagenesis of PTCL. TET2 coorperating with DNMT3A may contribute to the development and progression of PTCL. TET2 combining with DNMT3A could be used as markers in AITL diagnosis, which could provide new research and strategy for AITL diagnosis and treatment.
Graduate student: Sun Mengqi（Pathology）
Directed by Prof. Xiao-ming Xing KEY WORDS: Lymphoma, Peripheral T cell lymphoma, TET2, DNMT3A
目录
引言 (1)
材料及方法 (3)
1主要的实验仪器 (3)
2主要的实验试剂 (3)
3免疫组化相关试剂配置 (3)
4 研究对象 (4)
4.1 病例标本 (4)
5免疫组织化学方法象 (4)
5.1 P V-6000法的实验步骤 (4)
5.2免疫组织化学的判定标准 (5)
6数据统计分析方法 (5)
实验结果 (6)
1 PTCL的免疫分型 (6)
2 TET2和DNMT3A表达在PTCL中的表达 (8)
3 TET2和DNMT3A表达与PTCL临床病理特征的关系 (9)
4 TET2和DNMT3A表达与PTCL免疫表型关系 (13)
5 TET2和DNMT3A在PTCL中表达的相关性 (17)
讨论 (20)
结论 (24)
参考文献 (27)
综述 (30)
综述参考文献 (38)
攻读学位期间研究成果 (44)
致谢 (45)
学位论文独创性声明、学位论文知识产权权属声明 (46)
引言
引言
外周T细胞淋巴瘤（peripheral T-cell lymphomas, PTCL）是一组淋巴组织恶性增殖性病变，起源于胸腺后成熟T细胞或自然杀伤细胞，约占非霍奇金淋巴瘤10-15%左右。

不同于皮肤T细胞淋巴瘤，外周T细胞淋巴瘤具有更高的侵袭性，更差的预后，5年生存率仅在30%左右。

目前，临床上大都应用与B细胞淋巴瘤相同的治疗方案来治疗PTCL患者，但治疗效果并不理想，所以目前尚无有效的治疗方案[1]。

由于PTCL 在分子生物学上具有很大的异质性，对PTCL诊断的经验不足，对PTCL的分子机制知之甚少以及缺乏有效的分子标记物，导致PTCL分类复杂[1]。

根据WHO2008淋巴造血组织疾病分类，常见的PTCL亚型包括外周T细胞淋巴瘤，非特指（peripheral T-cell lymphomas, not otherwides, PTCL-NOS）、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤（angioimmunoblastic T cell lymphoma, AITL）、ALK阴性间变性大细胞淋巴瘤（anaplastic lymphoma kinase negative anaplastic large cell lymphoma, ALK-ALCL），ALK阳性的间变性大细胞淋巴瘤（anaplastic lymphoma kinase positive anaplastic large cell lymphoma, ALK+ALCL），NK-/T细胞淋巴瘤（NK-/T-cell lymphoma）和成人T细胞淋巴瘤（adult T cell lymphoma, ATCL）。

在西方国家，PTCL-NOS发病率最高(25.9%)，其次为AITL (18.5%)和ALCL (12%)。

而在亚洲国家，NK-/T细胞淋巴瘤和成人T细胞淋巴瘤则发病率最高[1]。

表观遗传学（epigenetics）是指在DNA的核苷酸序列不变前提下引起基因表达或细胞表型变化的遗传机制，主要包括DNA的胞嘧啶（cytosine, C）甲基化，组蛋白修饰和染色体重塑等。

DNA的胞嘧啶甲基化在基因组印迹、基因表达调节、X染色体失活、癌症发生等方面发挥重要作用。

近年来，有关表观遗传调控的基因近年来成为研究的热点。

TET、DNMT家族均属于表观遗传调节基因，主要参与DNA甲基化的调节。

TET2（ten-eleven-trantranslocation 2）基因属于TET基因家族，定位于染色体4q24，全长150kb，包含11个外显子[2]。

在TET2家族蛋白的近C端，有一个催化结构域，此结构域具有3个Fe2+和1个α-酮戊二酸（α-KG）结合位点，TET2蛋白近C端还有一段富含半胱氨酸区域，这两个区域组成的结构具有α-KG和Fe2+依赖的双加氧酶活性，可将5mC转化为5hmC，进而参与DNA主动去甲基化[3]。

与TET1和TET3不同的是，TET2在造血组织中表达较高[4]。

DNMT3A属于DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）基因家族，该基因位于染色体2p23上，含有23个外显子[5]。

DNA甲基化通常发生在胞嘧啶（C），第5位碳原子上，被甲基修饰后胞嘧啶变为5-甲基胞嘧啶（5-mC），通常甲基化的胞嘧啶后会有一个鸟嘌呤（G），通常形成胞嘧啶（C）-磷酸（p）-鸟嘌呤（G）结构，称为CpG，CpG富集的区域被称为CpG岛，这一过程的形成需要DNMT的催化。

DNMT3A和DNMT3B主要催化DNA的从头甲基化[6]。

随着基因测序水平的不断提高，TET2和DNMT3A突变在血液系统恶性肿瘤中相继被发现：在骨髓增生异常综合症（myelodysplastic syndrome, MDS）、骨髓增生性疾病（myeloproliferative disorders, MPD）、继发性急性髓细胞白血病（secondary acute myelocytic leukemia, sAML）、慢性粒单核细胞白血病（chronic myelomonocytic leukemia, CMML）中TET2的突变率分别为19%、12%、24%、22%[8]；22.1%的AML 患者存在DNMT3A突变，最常见的突变位点为R882且DNMT3A突变，常提示预后不良[9]。

随后，TET2突变被发现存在于淋巴瘤发生的早期及晚期阶段，在T细胞淋巴瘤中DNMT3A突变率为11%，73%DNMT3A突变者同时有TET2突变[10, 11]，二者突变主要存在于AITL和PTCL-NOS[12, 13]。

而TET1、TET3和DNMT1无论在髓系肿瘤还是PTCL中很少有突变[4]。

但对TET2及DNMT3A在PTCL中蛋白表达的研究较少，本文采用免疫组织化学的方法检测89例PTCL中TET2和DNMT3A的表达，来从蛋白水平研究TET2与DNMT3A表达水平改变及其与PTCL免疫分型及临床病理特征之间的关系，进一步探讨TET2和DNMT3A在PTCL发生发展中的作用，为PTCL明确诊断提供新的策略和方法。

由于NK-/T细胞淋巴瘤和成人T细胞淋巴瘤在亚洲发病率最高，但鲜有研究报道TET2和DNMT3A突变，且成人T细胞淋巴瘤主要高发于日本，所以本研究将主要研究对象放在其他几个亚型的PTCL。

材料及方法
材料及方法
1 主要的实验仪器
石蜡切片机Leica RM 2135
离心机（15ml，50ml）Thermo Scientific公司
-20℃~4℃冰箱Haier（青岛）
水浴箱（电热恒温）顺德市格兰仕电器实业有限公司
微波炉（格兰仕）HUBER polystat CCl
电热恒温干燥箱山东潍坊医疗器械厂
移液枪（1000μl、200μl、10μl）Labsystems Finland
高压消毒锅山东潍坊医疗器械厂
光学显微镜日本Olympus公司
光学照相系统3DHISTECH扫描系统
2 主要的实验试剂
TET2兔抗人多克隆抗体Abcam公司
DNMT3A兔抗人多克隆抗体Abcam公司
CD3抗体工作液北京中杉金桥生物技术有限公司
CD4抗体工作液北京中杉金桥生物技术有限公司
CD10抗体工作液北京中杉金桥生物技术有限公司BCL-6抗体工作液北京中杉金桥生物技术有限公司CXCL-13抗体工作液北京中杉金桥生物技术有限公司
CD30抗体工作液北京中杉金桥生物技术有限公司EMA抗体工作液北京中杉金桥生物技术有限公司ALK抗体工作液北京中杉金桥生物技术有限公司DAB显色试剂盒北京中杉金桥生物技术有限公司
PV-6000二步法检测试剂盒北京中杉金桥生物技术有限公司
3免疫组化相关试剂配
（1）内源性过氧化物酶的阻断剂：97ml的双蒸水，加入30%过氧化氢3ml，配成3%过氧化氢试剂。

（2）DAB显色剂：1ml双蒸水中，加入一滴（约50μl）浓缩缓冲液（试剂A），混合均匀后，将试剂B和试剂C各加入一滴，混匀，避光保存，并于30min内使用。

4 研究对象
4.1病例标本
收集892008年11月至2016年4月淋巴瘤标本，筛选出经病理诊断为外周T细胞淋巴瘤的病例的组织蜡块，剔除重复送检、穿刺组织标本，共89例。

其中男性46例（51.69%），女性43例（48.31%），年龄8岁-88岁，中位年龄61岁。

5 免疫组织化学方法
5.1 PV-6000法的实验步骤
（1）组织蜡块的切片：厚度3μm，连续切片，将载玻片在60℃-65℃下烘烤至蜡熔。

（2）切片脱蜡及水化
脱蜡：在二甲苯中浸泡2次，每次5min。

水化：分别在100%无水乙醇浸泡5min，95%乙醇浸泡5min，85%乙醇浸泡5min，75%乙醇浸泡5min。

（3）蒸馏水冲洗2次，每次3min。

（4）高压抗原修复：修复液为PH9.0的EDTA。

（5）室温下自然冷却。

（6）3%过氧化氢溶液室温孵育10min，阻断内源性过氧化物酶。

（7）PBS浸洗3次，每次5min。

（8）滴加一抗（50μl/张切片）
TET2兔抗人多克隆抗体浓度为1:300；
DNMT3A兔抗人多克隆抗体浓度为1:800；
CD3、CD4、CD10、BCL-6、CXCL-13、CD30、EMA、ALK均为即用型工作液。

37℃水浴箱孵育1h。

（9）PBS冲洗3次，每次5min。

（10）滴加二抗工作液（通用型），于37℃水浴箱中孵育20min。

（11）PBS冲洗3次，每次5min。

（12）滴加DAB显色剂，用显微镜观察控制显色深浅，满意后立即用自来水冲洗以终止反应。

（13）苏木素复染（轻微）。

（14）返蓝（1%氨水）。

（15）70-100%浓度梯度酒精脱水。

（16）二甲苯透明。

材料及方法
（17）中性树胶封片，光学显微镜观察。

用血管壁（TET2）和大鼠肺（DNMT3A）的切片作为阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

5.2 免疫组化结果的判定标准
TET2和DNMT3A染色均定位于细胞核或细胞质，染色结果采用半定量评估：随机选取5个高倍视野计数阳性细胞数阳性细胞率，0～5%记为0分，6%～25%记为1分，26%～50%记为2分，51%～75%记为3分，76%～100%记为4分；着色强度以多数阳性细胞呈现的染色强度记分，无阳性着色记为0分，浅黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分；将两者记分相加，0～3分为低表达，4分及以上为高表达[11]。

TET2细胞核表达及DNMT3A细胞质高表达例数较少，评分标准为0～2分为低表达，3分及以上为高表达。

6 数据统计分析方法
采用SPSS 21.0软件进行数据分析，各组之间数据比较采用卡方检验，两因素之间的相关性分析采用非参数Spearman等级相关分析。

P＜0.05被认为具有统计学意义。

实验结果
1 PTCL的免疫分型
在PTCL组织中，CD3阳性表达于细胞膜，CD20阳性表达于细胞膜，CD4阳性表达于细胞膜，CD10阳性表达于细胞膜，BCL-6阳性表达于细胞核，CXCL-13阳性表达于细胞质，CD30阳性表达于细胞膜/细胞质，EMA阳性表达于细胞膜/细胞质，ALK阳性表达于细胞质（见图1-5）。

89例PTCL中，AITL36例（40.45%），PTCL-NOS26例（29.21%），ALK-ALCL18例（20.22%），ALK+ALCL9例（10.11%）。

CD3表达于所有PTCL亚型组织中，但ALCL中阳性表达率较低（图1），CD20在PTCL组织中阳性表达较低（图1），图2示AITL及PTCL-NOS镜下形态，图3示AITL主要抗体表达情况，图4示PTCL-NOS主要抗体表达，图5示ALCL主要抗体表达及镜下形态，各亚型中主要抗体表达见表1。

图1 A：PTCL CD3表达；B：PTCL CD20表达（PV6000400X）
图2 A：AITL HE；B：PTCL-NOS HE（PV6000400X）
实验结果
图3 AITL主要抗体表达：（A）CD4膜+；（B）CD10膜+；（C）Bcl-6核+；
（D）CXCL-13质+（PV6000400X）
图4 PTCL-NOS主要抗体表达：（A）CD3膜+；（B）CD4膜+
（PV6000400X）
图5 ALCL主要的抗体表达：（A）CD30质/膜+；（B）EMA质/膜+（C）ALK质+；(D)ALCL
HE（PV6000400X）
表1 PTCL各亚型中主要免疫标记表达
PTCL分型主要免疫标记
AITL CD3+，CD4+，CD10+，Bcl-6+，CXCL-13+
PTCL-NOS CD3+，CD4+
ALK+ALCL CD30+，EMA+，ALK+，CD4+/-，CD3+/-
ALK-ALCL CD30+，EMA+，ALK-，CD4+/-，CD3+/-
2 TET2和DNMT3A表达在PTCL中的表达
TET2、DNMT3A均表达于细胞质或细胞核（见图6-7）。

89例PTCL中，TET2
图6 （A）TET2细胞质表达；（B）TET2细胞核表达（PV6000400X）
图7 （A）DNMT3A细胞质阳性表达；（B）DNMT3A细胞核阳性表达
（PV6000400X）
3 TET2和DNMT3A表达与PTCL临床病理特征的关系
TET2在临床Ⅲ+Ⅳ期PTCL患者中高表达率（67.4%）高于Ⅰ+Ⅱ期（40%），此差异虽无统计学意义，但处于临界水平（P＝0.061）（表2）。

在细胞质表达中，TET2在临床Ⅲ+Ⅳ期PTCL患者中的高表达率同样（67.4%）高于Ⅰ+Ⅱ期（40%），表达差异仍处于临界水平（P＝0.061）（表3）。

在有B症状的PTCL患者中，TET2细胞核高表达率（45%）高于无B症状者（8.11%），差异有统计学意义（P=0.003）（表3）。

DNMT3A在没有结外浸润的患者中的细胞核高表达率高于有结外浸润的患者，差异处于临界水平（P＝0.057）（表4）。

TET2的表达与PTCL患者的性别、年龄、LDH水平、IPI评分、结外浸润无关（P＞0.05），DNMT3A的表达与PTCL患者的
表2TET2、DNMT3A表达与PTCL临床病理特征的关系
临床病理参数n TET2表达DNMT3A表达
高表达低表达P值高表达低表达P值性别89
男462521 0.419 2224 0.156女432716 2716
年龄（岁）89
≤60 43 28 15 0.216 25 18 0.572 ＞60 46 24 22 24 22
分期58
I+II 15 6 9 0.061 9 6 0.488 III+IV 43 29 14 30 13
LDH（μ/H）45
≤245 29 17 12 0.272 22 7 0.869 ＞245 16 12 4 11 5
B症状57
有20 14 6 0.242 13 7 0.844 无37 20 17 25 12
IPI 38
0～2 18 9 9 0.179 13 5 1.000 3～5 20 15 5 15 5
结外浸润58
有17 10 7 0.879 9 8 0.135 无41 25 16 30 11
表3TET2细胞质和细胞核表达与PTCL临床病理特征的关系
临床病理参数n TET2胞质表达TET2胞核表达
高表达低表达P值高表达低表达P值性别89
男462521 0.719838 0.346 女432518 1132
年龄（岁）89
≤60432617 0.431 1132 0.430 ＞60462422 838
分期58
I+II 1569
0.061 213
0.655
III+IV 432914 1033 LDH（μ/H）45
≤245291712
0.502 524
0.815
＞2451611 5 412 B症状57
有2014 6
0.242 911
0.003
无372017 334 IPI 38
0～21899
0.208 315
1.000
3～52015 5 416 结外浸润58
有17107
0.879 611
0.158
无412516 635
表4DNMT3A细胞质和细胞核表达与PTCL临床病理特征的关系
临床病理参数n DNMT3A质表达DNMT3A核表达
高表达低表达P值高表达低表达P值性别89
男46739 0.144 2224 0.232女431231 2617
年龄（岁）89
≤6043934 0.926 2518 0.441 ＞60461036 2323
分期58
I+II 15411
0.92 87
0.249
III+IV 431429 3013 LDH（μ/H）45
≤24529821
0.725 227
0.606
＞24516610 11 5 B症状57
有20515
0.558 137
0.992
无371225 2413 IPI 38
0～218414
0.307 13 5
1.000
3～520812 15 5 结外浸润58
有17512
0.863 89
0.057
无411328 3011
4 TET2和DNMT3A表达与PTCL免疫表型关系
TET2和DNMT3A在AITL（83.3%，77.8%）中的阳性表达率均高于PTCL-NOS （50%，53.8%）、ALK-ALCL（22.8%，22.8%）、ALK+ALCL（44.4%，22.2%）和ALCL（33.3%，25.9%），差异有统计学意义（P＜0.05）（见表5-6），DNMT3A在PTCL-NOS中的高表达率与ALK-ALCL和ALK+ALCL相比无统计学差异（P＞0.05），但却明显高于ALCL（P＜0.05）（见表7）。

在细胞质表达中，TET2在AITL（83.3%）中的高表达率均高于PTCL-NOS （42.3%）、ALK-ALCL（22.8%）、ALK+ALCL（44.4%）和ALCL（33.3%），差异有统计学意义（P＜0.05），PTCL-NOS的高表达率与ALK-ALCL及ALK+ALCL之间的差异无统计学意义（P＞0.05）（见表8-10）。

DNMT3A在AITL（36.1%）中高表达率高于PTCL-NOS（11.53%），且差异有统计学意义（P＝0.029）；在AITL与ALK-ALCL（16.7%）及ALK+ALCL（0）的比较中未发现统计学差异，但却高于ALCL（11.1%），且差异有统计学意义（P＝0.024）（见表8-10）。

在细胞核表达中，TET2在AITL（19.4%）、PTCL-NOS（23.1%）及ALCL（22.2%）中表达差异均无统计学意义（P＞0.05）。

DNMT3A细胞核高表达率在各亚型之间均有差异，AITL（77.8%）高表达率均高于其他免疫亚型，差异均有统计学意义（见表11-13）。

ALK+ALCL和ALK-ALCL之间TET2和DNMT3A无论在细胞核还是在细胞质的表达差异均无统计学意义（P＞0.05）(见表14)。

表5TET2、DNMT3A表达在AITL和PTCL-NOS中表达的比较PTCL亚型n
TET2 DNMT3A
高表达低表达P值高表达低表达P值
AITL 36306
0.005288
0.048
PTCL-NOS 2613131412
表6TET2、DNMT3A表达在AITL和ALCL中表达的比较
PTCL亚型n
TET2 DNMT3A
高表达低表达P值高表达低表达P值
AITL 36306
＜0.001288
＜0.001
ALK-ALCL 18513513
AITL 36306
0.046288
0.006
ALK+ALCL 94527
AITL 36 30 6
0.00128 8
0.001
ALCL 27 9 18 7 20
表7TET2、DNMT3A表达在PTCL-NOS和ALCL中表达的比较
PTCL亚型n
TET2 DNMT3A
高表达低表达P值高表达低表达P值
PTCL-NOS 261313
0.1401412
0.086
ALK-ALCL 18513513
PTCL-NOS 261313
1.0001412
0.135
ALK+ALCL 94527
PTCL-NOS 26 13 13
0.21814 12
0.038
ALCL 27 9 18 7 20 表8TET2、DNMT3A细胞质表达在AITL和PTCL-NOS中表达的比较
PTCL亚型n
TET2 DNMT3A
高表达低表达P值高表达低表达P值
AITL 36306
0.0011323
0.029
PTCL-NOS 261115323
表9TET2、DNMT3A细胞质表达在AITL和ALCL中表达的比较
PTCL亚型n
TET2 DNMT3A
高表达低表达P值高表达低表达P值
AITL 36306
＜0.001 1323
0.14
ALK-ALCL 18513315
AITL 36306
0.0461323
0.084
ALK+ALCL 94509
AITL 36 30 6
0.00113 23
0.024
ALCL 27 9 18 3 24
表10TET2、DNMT3A细胞质表达在PTCL-NOS和ALCL中表达的比较
PTCL亚型n
TET2 DNMT3A
高表达低表达P值高表达低表达P值
PTCL-NOS 261115
0.325323
0.968
ALK-ALCL 18513315
PTCL-NOS 261115
1.000323
0.553
ALK+ALCL 94509
PTCL-NOS 26 11 15
0.4233 23
1.000
ALCL 27 9 18 3 24 表11TET2、DNMT3A细胞核表达在AITL和PTCL-NOS中表达的比较
PTCL亚型n
TET2 DNMT3A
高表达低表达P值高表达低表达P值
AITL 36729
0.787288
0.047
PTCL-NOS 266201412
表12TET2、DNMT3A细胞核表达在AITL和ALCL中表达的比较
PTCL亚型n
TET2
DNMT3A
高表达
低表达P值高表达低表达P值
AITL 36729
1.000288
＜0.001
ALK-ALCL 18315414
AITL 36729
0.654288
0.006
ALK+ALCL 93627
AITL 36729
0.941288
＜0.001
ALCL 27621621表13TET2、DNMT3A细胞核表达在PTCL-NOS和ALCL中表达的比较
PTCL亚型n
TET2
DNMT3A
高表达
低表达P值高表达低表达P值
PTCL-NOS 26620
0.8901412
0.036
ALK-ALCL 18315414
PTCL-NOS 26620
0.6651412
0.135
ALK+ALCL 93627
PTCL-NOS 26620
0.7291412
0.018
ALCL 27621621
表14TET2、DNMT3A在ALK阳性与ALK阴性ALCL中表达的比较ALCL亚型n
TET2 DNMT3A
高表达低表达P值高表达低表达P值
胞质表达ALK（－）18513
0.423
315
0.529 ALK（＋）94509
胞核表达ALK（－）18315
0.367
414
1.000 ALK（＋）93627
TET2/DNMT3A
表达ALK（－）18513
0.423
513
1.000 ALK（＋）94527
5 TET2和DNMT3A在PTCL中表达的相关性
在89例PTCL中，TET2与DNMT3A表达呈正相关关系（r＝0.384，P＜0.001）(见表15)；TET2细胞浆表达不但与DNMT3A细胞质表达（r＝0.350，P＝0.001）而且与DNMT3A细胞核表达（r＝0.365，P＜0.001呈正相关关系）（见表16）。

在AITL中，TET2与DNMT3A表达同样呈正相关关系（r＝0.478，P＝0.003）(见表15)；TET2细胞质表同样达与DNTM3A细胞质表达（r＝0.336，P＝0.045）及DNMT3A细胞核表达（r＝0.478，P＝0.003）呈正相关关系（见表16，图8-9）。

在PTCL-NOS及ALCL中TET2细胞质表达与DNMT3A表达无相关关系（P＞0.05）（见表15-16，图10）。

TET2细胞核表达与DNMT3A表达在PTCL及其各亚型之间均无相关关系（P＞0.05）（见表17）。

表15TET2表达和DNMT3A表达在PTCL各亚型中的相关性
TET2表达
DNMT3A表达
P值r值高表达低表达
PTCL
高表达低表达3715
＜0.0010.384 1225
AITL
高表达低表达264
0.0030.478 24
PTCL-NOS
高表达低表达85
0.4520.154 67
ALK-ALCL
高表达低表达23
0.5020.169 310
ALK+ALCL
高表达低表达13
0.8790.060 14
ALCL
高表达低表达36
0.5530.120 414
实验结果
表16TET2细胞质表达和DNMT3A表达在PTCL各亚型中的相关性
TET2胞质表达
DNMT3A胞质P值r值DNMT3A胞核P值r值高表达低表达高表达低表达
PTCL
高表达低表达1733
0.0010.350
3515
＜0.0010.365 2371326
AITL
高表达低表达1317
0.0450.336
264
0.0030.478 0624
PTCL-NOS
高表达低表达29
0.3840.178
74
0.4120.168 11478
ALCL
高表达低表达17
0.2090.250
27
1.0000 217414
ALK-ALCL
高表达低表达23
0.1110.388
14
0.896-0.033 112310
ALK+ALCL
高表达低表达04
- -
13
0.8790.060 0514
表17TET2细胞核表达和DNMT3A表达在PTCL各亚型中的相关性
TET2胞核表达
DNMT3A胞质
P值r值
DNMT3A胞核
P值r值高表达低表达高表达低表达
PTCL
高表达低表达316
0.437-0.083
910
0.523 -0.069 17533931
AITL
高表达低表达26
0.472 -0.124
71
0.468 0.125 1117217
PTCL-NOS
高表达低表达06
0.333 -0.198
24
0.268 -0.225 317128
ALK-ALCL
高表达低表达23
0.426 0.200
03
0.339 -0.239 112411
ALK+ALCL
高表达低表达03
- -
15
0.626 0.189 0615
ALCL
高表达低表达15
0.639 0.094
15
0.723 -0.071 219516
实验结果
图8同一例AITL标本中的表达：（A）TET2细胞质表达；（B）DNMT3A细胞质表达
（PV6000400X）
图9同一例AITL标本中的表达：（A）TET2细胞质表达；（B）DNMT3A细胞核表达
（PV6000400X）
图10同一例PTCL标本中的阴性表达：（A）TET2；（B）DNMT3A（PV6000400X）
讨论
表观遗传学（epigenetics）是指在DNA的核苷酸序列不变前提下引起基因表达或细胞表型变化的遗传机制，主要包括DNA的胞嘧啶（cytosine, C）甲基化，组蛋白修饰和染色体重塑等。

DNA的胞嘧啶甲基化（DNA methylation）在基因组印迹、基因表达调节、X染色体失活、细胞增殖和分化等方面发挥重要作用。

其异常可导致干细胞功能改变及肿瘤的发生与发展。

TET（ten-eleven-trantranslocation）基因家族属于表观遗传的调节基因。

TET基因家族包括TET1（ten-eleven-trantranslocation 1）、TET2（ten-eleven-trantranslocation 2）和TET3（ten-eleven-trantranslocation 3）基因，分别表达TET1蛋白、TET2蛋白和TET3蛋白。

TET1蛋白主要表达于胎儿肝组织，TET3主要表达于外周血，而TET2蛋白在人类组织中表达最为广泛，主要在造血组织及外周血中表达[12]。

TET2基因属于TET基因家族，定位于染色体4q24，包含11个外显子，表达TET2蛋白[2]。

TET2蛋白的羧基（C）末端包含具有α-KG和Fe2+依赖的β-双螺旋双加氧酶活性的结构域[3,
13]。

与TET1和TET3蛋白不同的是，TET2蛋白没有进化保守区域——CXXC结构域
[14]。

TET2可将5-甲基胞嘧啶（5mC）转化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、5fC、5caC，5mC进而通过DNA修复机制被去除，来参与DNA去甲基化，来诱导DNA主动去甲基化，进而下调DNA甲基化水平，因此TET2是DNA去甲基化过程中的关键酶[13, 15-18]。

TET2还可通过活化诱导胞嘧啶核苷脱氨酶，使胞嘧啶最终变为胸腺嘧啶，最终被DNA错配修复系统切除，这一途径为间接去甲基化途径[19, 20]。

TET不仅通过DNA去甲基化，而且通过染色质修饰，例如H2B的O-GlcNA化或H3K4三甲基化，通过将OGT 系到靶基因启动子来调节基因转录[21]。

在没有TET2的情况下，HSC的整体分化潜力受阻，而且单核细胞和巨噬细胞谱系将会扩增[22-24]。

在TET2缺失的小鼠模型中观察到的最常见的表型类似于人类慢性髓系单核细胞白血病的疾病[9, 22, 24]。

在骨髓恶性肿瘤患者中发现TET2突变可导致TET2酶失活并与5hmC水平降低[25]。

在淋巴恶性肿瘤中也检测到TET2突变，这表明突变发生在具有髓系和淋巴细胞潜能的早期造血祖细胞中[9]。

TET2突变通常是单等位的，表明TET2单倍体剂量不足有助于造血干细胞转化[9, 24, 26]。

此外，在AML中普遍存在的异柠檬酸脱氢酶1和2（IDH1, 2）的杂合获得功能突变引起TET2催化活性的抑制，并导致5mC水平增加，类似于由TET2功能失活引起的效应[27]。

TET2突变在骨髓肿瘤中的发现表明TET2功能可以是致癌触发点和生理造血调节剂[2, 7]。

TET2突变导致许多血液系统疾病病人体内的TET2蛋白功能降低或丢失[7]。

TET2突变主要通过影响TET2蛋白活性而引起髓系恶性肿瘤[25]。

TET2为抑癌基因，TET2突变后，5hmC 总量会显著减少，说明TET2突变为失活突变[7, 28]。

TET2基因突变存在于CD34+的造
讨论
血干细胞或造血祖细胞[7]，说明在疾病发生早期即存在TET2突变。

在淋巴瘤发生的早期和晚期阶段均存在TET2突变[9]，说明TET2突变可能与淋巴瘤的发生发展有关。

TET2基因的敲除导致小鼠有Tfh特征的T细胞淋巴瘤的发生，说明TET2突变对人类有Tfh特征的T细胞淋巴瘤的发生可能有重要作用[29]，进一步说明TET2突变与淋巴瘤尤其是AITL发生发展有关的可能性。

在淋巴瘤中也存在TET2突变，且TET2在AITL 中的突变率最常见，其次为PTCL-NOS，在ALCL中TET2的突变率较低[28, 30, 31]，可以推断，TET2突变可能与PTCL的发生发展有着密切关系。

在乳腺癌、肝癌、肺癌及前列腺癌等组织中5hmC水平较正常组织水平低，说明了TET2基因表达降低或TET2蛋白功能异常的可能性[32]。

TET2和5hmC在平滑肌细胞中主要表达于细胞核[33]。

但在本研究中，TET2细胞质而不是细胞核表达明显高于PTCL-NOS与ALCL，与上述研究结果不一致且与抗体说明书不一致，说明在PTCL中TET2蛋白异常包括表达部位改变的可能性，或存在TET2基因突变导致TET2蛋白表达部位改变。

我们研究发现TET2蛋白在AITL中高表达率均高于其他PTCL亚型，而在实体肿瘤中TET2蛋白表达水平要低于正常组织，且TET2突变为失活突变，说明在AITL中可能存在类似于P53突变的TET2基因突变，导致突变后TET2蛋白表达水平增高，并且可能蛋白表达部位同时发生了改变并且同时影响了蛋白的活性。

或者同时存在其他基因突变，如IDH1/2[30]，导致TET2功能缺失或异常。

细胞质表达的TET2蛋白在AITL中表达率均高于PTCL-NOS和ALCL，提示TET2蛋白有作为标记物来辅助AITL诊断的可能性。

DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase，DNMT）基因家族包括DNMT1（DNA Methyltransferase 1）和DNMT3（DNA Methyltransferase 3），DNMT3包括DNMT3A （DNA Methyltransferase 3A）和DNMT3B（DNA Methyltransferase 3B）[34]。

在哺乳动物中，催化胞嘧啶甲基化的主要酶是DNMT1和DNMT3家族的成员。

DNMT1主要维持DNA复制后来自半甲基5化底物的胞嘧啶甲基化模式[35]。

DNMT3家族包括2种活性酶，DNMT3a和DNMT3b，其中每一种酶都有几种同工型。

DNMT3a和DNMT3b 被称为从头甲基转移酶，因为它们优先作用于未甲基化的DNA底物[34]。

DNMT3A位于染色体2p23，共有24个外显子[8, 36]。

DNMT3A编码一个甲基化转移酶，将CpG岛的胞嘧啶转化为甲基化胞嘧啶，进而参与DNA从头甲基化过程[37]。

在小鼠的造血干细胞中，单独的DNMT3A或DNMT3B的缺失或DNMT3A和DNMT3B共同缺失并不能影响髓系和淋巴系造血干细胞的分化，说明其DNMT3A 和DNMT3B对小鼠造血干细胞的自我更新而不是分化十分重要[38]。

然而，与DNMT3A野生型小鼠相比较，DNMT3A缺失的小鼠造血干细胞的多能性基因表达上调，而参与分化的基因表达下调，说明DNMT3A对维持造血干细胞的分化潜能十分重要[39]。

而且，DNMT3A缺失导致全基因组甲基化水平降低，并且导致造血干细胞中复杂的DNA胞嘧啶甲基化模式，包括高甲基化区域（CpG岛），低甲基化区
域[39]。

在将近三分之一的AML或MDS患者体内存在导致DNMT3A催化失活的突变，并且与不良预后有关，说明DNMT3A对维持正常造血功能十分重要[8, 40, 41]。

在小鼠造血系统中，DNMT3A的缺失导致对于长期造血干细胞（LT-HSC）的分化和逐渐扩增的自我更新倾向[39]。

DNMT3A缺失的HSCs的全基因组为低甲基化水平，其中高甲基化的病灶区域可以归因于残留的DNMT3B活性[42]。

DNMT3A缺失的HSC导致了一系列骨髓和淋巴肿瘤的发展，这可能为早期白血病转化的潜在机制[43]。

在造血疾病中发现的大多数DNMT3A突变发生在甲基转移酶结构域（MTD）内的密码子R882[8]。

在AML中，约65％的DNMT3A突变是影响密码子R882的杂合错义突变[8]。

突变蛋白可以与野生型DNMT3A二聚化，但是不能形成更具活性的蛋白的四聚体形式[44]。

低水平的DNMT3A同源四聚体导致甲基转移酶活性的显着降低，所以在患有R882突变的患者中出现全基因组低甲基化[45]。

目前对DNMT3A 突变后对其蛋白表达及DNA甲基化水平的改变没有一致结果。

Shah MY等认为在存在DNMT3A突变和不存在DNMT3A突变的AML中，DNMT3A基因表达水平、5mC水平及基因组甲基化没有差别，DNMT3A突变没有直接改变DNMT3A的甲基化转移酶的活性[36]。

Ley TJ等研究表明在发生DNMT3A突变和未突变的细胞中DNMT3A蛋白表达水平和5mC水平没有明显不同[8]。

Steven M等认为DNMT3A突变使DNMT3A酶活性降低[46]。

Yan XJ等研究发现，DNMT3A突变的AML患者的甲基化水平较未突变者高[40]。

在PTCL中，DNMT3A在AITL中最常见，突变率33-38.5%[28, 30, 31]，说明DNMT3A突变可能在淋巴瘤发生发展中发挥一定作用。

在本研究中，DNMT3A的在AITL中的高表达率均高于PTCL-NOS和ALCL，并且细胞质及细胞核表达在AITL中的表达也均高于PTCL-NOS和ALCL，说明DNMT3A 蛋白不同的表达部位在AITL中的表达差异并不大。

本研究中发现DNMT3A细胞质及细胞核均有表达，与抗体说明书一致。

DNMT3A在AITL中高表达率较高同时也说明在AITL中可能存在DNMT3A基因突变导致其表达水平发生改变，但对其表达部位改变可能没有太大影响。

本研究结果说明DNMT3A异常有参与AITL发生发展的可能性，DNMT3A具有作为AITL辅助诊断标记物的可能性。

在TET缺失的情况下，HSC的整体分化潜力受阻[22-24]，DNMT3A突变可以影响造血干细胞的增殖和分化[38, 39]，说明TET2和DNMT3A在DNA甲基化的调节过程中可能具有协同作用，且DNMT3A催化的启动子区域的甲基化与TET2催化的主动去甲基化可能为一动态平衡过程，同时说明二者异常可导致基因组甲基化的异常，进而导致肿瘤的发生。

DNMT3A突变存在于在PTCL中，且DNMT3A突变的病人中有73%同时伴有TET2突变，可能由于TET2和DNMT3A突变使胞嘧啶的甲基化和去甲基化过程失调[10]。

Oreofe O等人发现，DNMT3A在AITL中的突变率为33%，且同时都有TET2突变[28]。

这些都说明TET2与DNMT3A异常可能参与了PTCL的发生与发展。

本
讨论
研究发现，TET2表达与DNMT3A表达在PTCL中呈正相关关系，进一步分层发现在AITL中TET2表达与DNMT3A表达呈正相关关系，说明TET2与DNMT3A在参与DNA 甲基化调控过程中具有协同作用的可能性，且二者异常可能共同参与了PTCL的发生与发展，也提示TET2与DNMT3A蛋白可联合作为诊断AITL分子标记物的可能性。

PTCL是一组具有明显异质性的恶性淋巴瘤，其发病机制尚未明确。

临床上大都应用治疗B细胞淋巴瘤的方案来治疗PTCL，导致其治疗效果不理想，预后差。

目前，对于DNA甲基化异常的研究，对于寻找明确诊断PTCL的标记物和治疗PTCL的靶向药物具有重要意义。

TET2和DNMT3A作为DNA甲基化的重要调节因子，在肿瘤的发生发展中发挥作用。

本研究发现TET2胞浆表达和DNMT3A表达在AITL中的高表达率均高于PTCL-NOS和ALCL，且二者表达成正相关，为PTCL亚型AITL的明确诊断提供了新的策略。

我们还发现TET2在临床Ⅲ+Ⅳ期PTCL的胞质高表达率高于Ⅰ+Ⅱ期，有B症状的PTCL患者TET2胞核高表达率高于无B症状者，差异虽无统计学意义，但处于临界水平；虽然DNMT3A在没有结外浸润的患者中的细胞核高表达率高于有结外浸润的患者且差异处于临界水平，但由于DNMT3A细胞质及细胞核均有表达，在细胞质及细胞核共同评分中，DNMT3A在有无结外浸润的患者中的表达无差异，这些为PTCL患者的治疗提供了新线索。

本研究发现TET2细胞质表达在AITL中高表达率高于其他PTCL亚型，细胞核表达无差异，与Liu[33]等人的研究结果及抗体说明书不一致。

本研究中DNMT3A表达部位与抗体说明书一致，所以并未对其表达部位进行进一步研究。

为进一步研究TET2表达部位改变的意义，本研究对TET2进行基因测序，以分析TET2表达部位与基因突变的关系，目前引物已经设计完毕，下一步会继续进行基因测序，分析蛋白表达异常与基因突变的关系。