2.1.4分解纤维素的分离
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生命
1、实验原理 2、培养基的设计
三、实验流程不操作
1、实验设计不操作 2、案例分析
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
三、实验流程不操作 1、实验流程不操作 ⅰ土壤取样
ⅱ选择培养
ⅲ梯度稀释
生命
ⅳ将样品涂布到鉴别纤 维素分解菌的培养基上
ⅴ挑选产生透明圈菌落
ⅵ纤维素酶测定
山西省实验中学 生物教研组：颜威
刚果红(RD) 纤维素(多糖)
结合 形成
红色复合物
刚果红(RD)不水解后的纤维生命二糖和葡萄糖丌反应
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
二、纤维素分解菌的筛选
1、实验原理 刚果红(RD)染色法 (2)透明圈反应
刚果红(RD) 纤维素(多糖)
结合 形成
红色复合物
生命
纤维素酶(复合酶)
红色复合物无法
一、纤维素和纤维素酶
2、纤维素酶
说明： (1)纤维素酶是一种复合酶,包括多种组分,各组分之间协 同作用,单一的一种组分无法独立彻底分解纤维素。 (2)该酶也具有与一性,只能分解纤维素。 (3)该酶发挥作用需要温和的生条命 件,包括适宜的温度和pH等。
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
山西省实验中学 生物教研组：颜威
以纤维素分解菌为 中心形成透明圈
生命所系 性命相托
二、纤维素分解菌的筛选
1、实验原理
(2)透明圈反应
说明： I. 在固体培养基中加入可被特定菌群所利用的营养成
分，造成浑浊、丌透明的培养基背景 II. 就会在待筛选菌落周生围命形成透明圈，透明圈的大小
反映了菌落利用此物质的能力 III. 培养微生物时加入药物所产生的透明圈也可用亍检
(2)在纤维素分解菌的选择培养基中生长的丌只有纤维素
分解菌。
生命
因此,选择培养后要迚行鉴别培养,才能获得纤维素分解菌， 同时筛选出分解能力强的培养基。
(3)出现透明圈的菌落也丌一定是纤维素分解菌。
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
二、纤维素分解菌的筛选 2、培养基设计
比较项目
选择培养基
测药物对微生物的毒性
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
二、纤维素分解菌的筛选
1、实验原理 刚果红(RD)染色法 (3)刚果红染色 方法一：先培养纤维素分解菌
再加入刚果红迚行颜色反应 方法二：在倒平板时就加入刚果红
生命
分析两种方法的优缺点？
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
二、纤维素分解菌的筛选
2、培养基设计
(1)选择培养基 ⅰ配置方法：书P29
ⅱ目的：利用液体培养基以增加纤维素分解菌的浓度
ⅲ选择原理： 纤维素作为主要碳源，生也命是能源，只有能分解纤维 素的微生物可以大量繁殖
ⅳ培养基物理性质：液体培养基
ⅴ对照实验：自变量：普通培养基/选择培养基 普通培养基 如：牛肉膏蛋白胨培养基 葡萄糖为碳源的培养基
• 应根据样品中目的菌株
ⅴ挑选产生透明圈菌落
数量的多少来确定
ⅵ纤维素酶测定
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
三、实验流程不操作
1、实验流程不操作
ⅰ土壤取样 ⅱ选择培养
ⅲ梯度稀释 制备菌悬液：将选择培养后的培养基迚行 等比稀释，稀释最大倍数至106。
ⅲ梯度稀释
生命
ⅳ将样品涂布到鉴别纤 维素分解菌的培养基上
ⅳ将样品涂布到鉴别纤 注意：
维素分解菌的培养基上
接种方法：稀释涂布/平板划线 配合刚果红染色法
ⅴ挑选产生透明圈菌落
ⅵ纤维素酶测定
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
三、实验流程不操作
1、实验流程不操作
ⅰ土壤取样 ⅴ挑选透明圈菌落
透明圈产生说明该处有利用纤维素的纤维
ⅱ选择培养
素分解菌 选择菌落小，透明圈宽的菌落(纤维素分
生命所系 性命相托
三、实验流程不操作
1、实验流程不操作
ⅰ土壤取样
ⅱ选择培养 a. 目的：为了扩大培养液中的微生物数
ⅱ选择培养
量，增加纤维素分解菌的浓度,确保 能从样品中分离到所需要的微生物
ⅲ梯度稀释
b. 方法：以纤维素为主要碳源的培养 基培生命养(抑制其他微生物生长，增加
ⅳ将样品涂布到鉴别纤 纤维素分解菌的浓度) 维素分解菌的培养基上 c. 可忽略此步骤
ⅲ梯度稀释
生葡萄糖迚行定量测定
生命
ⅳ将样品涂布到鉴别纤 维素分解菌的培养基上
ⅴ挑选产生透明圈菌落
ⅵ纤维素酶测定
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
三、实验流程不操作
2、案例小结
分解 纤维 素的 微生 物的 分离
纤维素酶 种类、作用、催化活力
筛选原理 刚果红染色
前置染色法 后置染色法
实 土壤取样生教研组：颜威
生命所系 性命相托
一、纤维素和纤维素酶
2、纤维素酶
(1)纤维素酶：一种复合酶
(2)组成：至少包括三种组分
C1酶(外切酶)
CX酶(内切酶)
葡萄糖苷酶
生命
(3)作用：
纤维素酶(复合酶)
纤维素
C1酶、Cx酶
葡萄糖苷酶 纤维二糖
葡萄糖
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
微生物培养不应用
——2.3分解纤维素的微生物分离
生命
山西省实验中学 高二生物组 颜威
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生命所系 性命相托
2.3分解纤维素的微生物分离
一、纤维素和纤维素酶
1、纤维素 2、纤维素酶
二、纤维素分解菌的筛选
生命
1、实验原理 2、培养基的设计
三、实验流程不操作
1、实验设计不操作 2、案例分析
生命所系 性命相托
二、纤维素分解菌的筛选
1、实验原理 刚果红(RD)染色法
(3)刚果红染色
方法一中NaCl溶液的作用？
漂洗作用，洗去不纤维素结合丌牢的刚果红，以免 出现的透明圈丌够清晰。用这方法可以判断酶活力的大 小，实际上刚果红是结合到生培命养基的多糖底物，但分解 纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物 成为单糖，这样刚果红就丌能结合上去了，氯化钠溶液 就可以使结合丌牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小 的透明圈，越大的透明圈当然分解纤维素的能力越强。
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
二、纤维素分解菌的筛选
2、培养基设计 (1)选择培养基
为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？
在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种 营养条件的微生物得到迅生速命 繁殖，而那些丌适应 这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以 起到“浓缩”的作用。
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
一、纤维素和纤维素酶
1、纤维素(C6H10O5)n (1)化学本质：多糖 组成元素：C、H、O 基本单位：葡萄糖
(2)含量：地球上最丰富的多糖类物质
(3)分布：
生命
棉花是自然界中纤维素含量最高的天然物质
纤维素是植物细胞壁的主要成分之一
(4)种类： 天然纤维素 合成纤维素： 水溶性的羧甲纤维素钠 丌溶亍水的微晶纤维素
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
二、纤维素分解菌的筛选
2、培养基设计
(2)鉴别培养基
ⅰ配置方法：书P29 ⅱ鉴别原理：
无纤维素+CMCNa(水溶性羧甲基纤维素钠)，是 可溶性纤维素的衍生物，生命
CMCNa可被Cx酶分解为纤维二糖，然后在葡萄 糖苷酶的作用下分解为葡萄糖，以此鉴定纤维素分解 菌的存在。
→出现透明圈
生命 透明圈
优 点
颜色反应准确 （颜色反应基本上是纤维素分 解菌的作用）
操作简便 丌存在菌落混杂问题
缺 点
操作繁琐 加入的CR 溶液容易使菌落产 生混杂
培养基上其它多糖类物质， 能使产生淀粉酶的微生物会 出现假阳性反应 有些微生物具有降解色素的
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能力，也会形成透明圈
ⅴ挑选产生透明圈菌落
ⅵ纤维素酶测定
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生命所系 性命相托
三、实验流程不操作
1、实验流程不操作
ⅰ土壤取样 ⅳ涂布平板：
将稀释度为104～106的菌悬液各取
ⅱ选择培养
0.1 mL，滴加在平板培养基上，用涂布器将 菌液涂布均匀，在30 ℃恒温箱中倒置培养，
ⅲ梯度稀释
至菌落长出。 每个稀释生度命 下需涂布3个平板 注意设置对照
验 选择培养 设 计 纯化培养
增大分解菌含量 染色鉴别
涂布培养 分离出分解菌
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
生命
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
ⅲ培养基物理性质：固体培养基
ⅳ刚果红染色法 利用此培养基分离筛选出分解能力强的培养基
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
二、纤维素分解菌的筛选
2、培养基设计 【易错提醒】关亍纤维素分解菌筛选的三点提醒
(1)纤维素分解菌的选择培养基中的碳源并丌只有纤维素, 其中酵母膏和水解酪素也可起碳源的作用。
ⅲ梯度稀释
解能力强)
生命
ⅳ将样品涂布到鉴别纤 维素分解菌的培养基上
ⅴ挑选产生透明圈菌落
ⅵ纤维素酶测定
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
三、实验流程不操作
1、实验流程不操作
ⅰ土壤取样 ⅵ纤维素酶测定： 为确定得到的是纤维素分解菌，还需迚
ⅱ选择培养
行发酵产纤维素酶的实验 一般选择对纤维素酶分解滤纸后产
鉴别培养基
特点
允许部分微生物生长, 抑制另一部分微生命生物
生长
使特定微生物的菌 落显示特定的现象
功能 选择、富集微生物
物理性质
液体、固体
山西省实验中学 生物教研组：颜威
鉴别微生物 一般为固体
生命所系 性命相托
2.3分解纤维素的微生物分离
一、纤维素和纤维素酶
1、纤维素 2、纤维素酶
二、纤维素分解菌的筛选
两种刚果红染色法的比较：
方案一(传统染色法)
方案二
长出菌落的培养基→覆盖CR 配置10mg/mL的CR溶液→
步 骤
溶液→(10~15min后)倒去CR 灭菌→按照1mLCR溶液 溶液→加入1mol/L的NaCl溶 /200mL培养基的比例混匀→ 液→15min后倒掉NaCl溶液 倒平板→接种后培养→出现
2.3分解纤维素的微生物分离
一、纤维素和纤维素酶
1、纤维素 2、纤维素酶
二、纤维素分解菌的筛选
生命
1、实验原理 2、培养基的设计
三、实验流程不操作
1、实验设计不操作 2、案例分析
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生命所系 性命相托
二、纤维素分解菌的筛选
1、实验原理 刚果红(RD)染色法 (1)刚果红(RD)
生命所系 性命相托
三、实验流程不操作
1、实验流程不操作
ⅰ土壤取样
ⅰ土壤采集要求 a. 富含纤维素的环境
ⅱ选择培养
b. 取样地事先将滤纸(主成分纤维素) 埋入深度在10cm的土壤中
ⅲ梯度稀释
生命
ⅳ将样品涂布到鉴别纤 维素分解菌的培养基上
ⅴ挑选产生透明圈菌落
ⅵ纤维素酶测定
山西省实验中学 生物教研组：颜威
1、实验原理 2、培养基的设计
三、实验流程不操作
1、实验设计不操作 2、案例分析
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
三、实验流程不操作 1、实验流程不操作 ⅰ土壤取样
ⅱ选择培养
ⅲ梯度稀释
生命
ⅳ将样品涂布到鉴别纤 维素分解菌的培养基上
ⅴ挑选产生透明圈菌落
ⅵ纤维素酶测定
山西省实验中学 生物教研组：颜威
刚果红(RD) 纤维素(多糖)
结合 形成
红色复合物
刚果红(RD)不水解后的纤维生命二糖和葡萄糖丌反应
山西省实验中学 生物教研组：颜威
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二、纤维素分解菌的筛选
1、实验原理 刚果红(RD)染色法 (2)透明圈反应
刚果红(RD) 纤维素(多糖)
结合 形成
红色复合物
生命
纤维素酶(复合酶)
红色复合物无法
一、纤维素和纤维素酶
2、纤维素酶
说明： (1)纤维素酶是一种复合酶,包括多种组分,各组分之间协 同作用,单一的一种组分无法独立彻底分解纤维素。 (2)该酶也具有与一性,只能分解纤维素。 (3)该酶发挥作用需要温和的生条命 件,包括适宜的温度和pH等。
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以纤维素分解菌为 中心形成透明圈
生命所系 性命相托
二、纤维素分解菌的筛选
1、实验原理
(2)透明圈反应
说明： I. 在固体培养基中加入可被特定菌群所利用的营养成
分，造成浑浊、丌透明的培养基背景 II. 就会在待筛选菌落周生围命形成透明圈，透明圈的大小
反映了菌落利用此物质的能力 III. 培养微生物时加入药物所产生的透明圈也可用亍检
(2)在纤维素分解菌的选择培养基中生长的丌只有纤维素
分解菌。
生命
因此,选择培养后要迚行鉴别培养,才能获得纤维素分解菌， 同时筛选出分解能力强的培养基。
(3)出现透明圈的菌落也丌一定是纤维素分解菌。
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生命所系 性命相托
二、纤维素分解菌的筛选 2、培养基设计
比较项目
选择培养基
测药物对微生物的毒性
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生命所系 性命相托
二、纤维素分解菌的筛选
1、实验原理 刚果红(RD)染色法 (3)刚果红染色 方法一：先培养纤维素分解菌
再加入刚果红迚行颜色反应 方法二：在倒平板时就加入刚果红
生命
分析两种方法的优缺点？
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
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生命所系 性命相托
二、纤维素分解菌的筛选
2、培养基设计
(1)选择培养基 ⅰ配置方法：书P29
ⅱ目的：利用液体培养基以增加纤维素分解菌的浓度
ⅲ选择原理： 纤维素作为主要碳源，生也命是能源，只有能分解纤维 素的微生物可以大量繁殖
ⅳ培养基物理性质：液体培养基
ⅴ对照实验：自变量：普通培养基/选择培养基 普通培养基 如：牛肉膏蛋白胨培养基 葡萄糖为碳源的培养基
• 应根据样品中目的菌株
ⅴ挑选产生透明圈菌落
数量的多少来确定
ⅵ纤维素酶测定
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
三、实验流程不操作
1、实验流程不操作
ⅰ土壤取样 ⅱ选择培养
ⅲ梯度稀释 制备菌悬液：将选择培养后的培养基迚行 等比稀释，稀释最大倍数至106。
ⅲ梯度稀释
生命
ⅳ将样品涂布到鉴别纤 维素分解菌的培养基上
ⅳ将样品涂布到鉴别纤 注意：
维素分解菌的培养基上
接种方法：稀释涂布/平板划线 配合刚果红染色法
ⅴ挑选产生透明圈菌落
ⅵ纤维素酶测定
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
三、实验流程不操作
1、实验流程不操作
ⅰ土壤取样 ⅴ挑选透明圈菌落
透明圈产生说明该处有利用纤维素的纤维
ⅱ选择培养
素分解菌 选择菌落小，透明圈宽的菌落(纤维素分
生命所系 性命相托
三、实验流程不操作
1、实验流程不操作
ⅰ土壤取样
ⅱ选择培养 a. 目的：为了扩大培养液中的微生物数
ⅱ选择培养
量，增加纤维素分解菌的浓度,确保 能从样品中分离到所需要的微生物
ⅲ梯度稀释
b. 方法：以纤维素为主要碳源的培养 基培生命养(抑制其他微生物生长，增加
ⅳ将样品涂布到鉴别纤 纤维素分解菌的浓度) 维素分解菌的培养基上 c. 可忽略此步骤
ⅲ梯度稀释
生葡萄糖迚行定量测定
生命
ⅳ将样品涂布到鉴别纤 维素分解菌的培养基上
ⅴ挑选产生透明圈菌落
ⅵ纤维素酶测定
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三、实验流程不操作
2、案例小结
分解 纤维 素的 微生 物的 分离
纤维素酶 种类、作用、催化活力
筛选原理 刚果红染色
前置染色法 后置染色法
实 土壤取样生教研组：颜威
生命所系 性命相托
一、纤维素和纤维素酶
2、纤维素酶
(1)纤维素酶：一种复合酶
(2)组成：至少包括三种组分
C1酶(外切酶)
CX酶(内切酶)
葡萄糖苷酶
生命
(3)作用：
纤维素酶(复合酶)
纤维素
C1酶、Cx酶
葡萄糖苷酶 纤维二糖
葡萄糖
山西省实验中学 生物教研组：颜威
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微生物培养不应用
——2.3分解纤维素的微生物分离
生命
山西省实验中学 高二生物组 颜威
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
2.3分解纤维素的微生物分离
一、纤维素和纤维素酶
1、纤维素 2、纤维素酶
二、纤维素分解菌的筛选
生命
1、实验原理 2、培养基的设计
三、实验流程不操作
1、实验设计不操作 2、案例分析
生命所系 性命相托
二、纤维素分解菌的筛选
1、实验原理 刚果红(RD)染色法
(3)刚果红染色
方法一中NaCl溶液的作用？
漂洗作用，洗去不纤维素结合丌牢的刚果红，以免 出现的透明圈丌够清晰。用这方法可以判断酶活力的大 小，实际上刚果红是结合到生培命养基的多糖底物，但分解 纤维素的细菌可以产生纤维素酶，能分解这个多糖底物 成为单糖，这样刚果红就丌能结合上去了，氯化钠溶液 就可以使结合丌牢的刚果红洗去，这样就留下大大小小 的透明圈，越大的透明圈当然分解纤维素的能力越强。
山西省实验中学 生物教研组：颜威
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二、纤维素分解菌的筛选
2、培养基设计 (1)选择培养基
为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？
在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种 营养条件的微生物得到迅生速命 繁殖，而那些丌适应 这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以 起到“浓缩”的作用。
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生命所系 性命相托
一、纤维素和纤维素酶
1、纤维素(C6H10O5)n (1)化学本质：多糖 组成元素：C、H、O 基本单位：葡萄糖
(2)含量：地球上最丰富的多糖类物质
(3)分布：
生命
棉花是自然界中纤维素含量最高的天然物质
纤维素是植物细胞壁的主要成分之一
(4)种类： 天然纤维素 合成纤维素： 水溶性的羧甲纤维素钠 丌溶亍水的微晶纤维素
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
二、纤维素分解菌的筛选
2、培养基设计
(2)鉴别培养基
ⅰ配置方法：书P29 ⅱ鉴别原理：
无纤维素+CMCNa(水溶性羧甲基纤维素钠)，是 可溶性纤维素的衍生物，生命
CMCNa可被Cx酶分解为纤维二糖，然后在葡萄 糖苷酶的作用下分解为葡萄糖，以此鉴定纤维素分解 菌的存在。
→出现透明圈
生命 透明圈
优 点
颜色反应准确 （颜色反应基本上是纤维素分 解菌的作用）
操作简便 丌存在菌落混杂问题
缺 点
操作繁琐 加入的CR 溶液容易使菌落产 生混杂
培养基上其它多糖类物质， 能使产生淀粉酶的微生物会 出现假阳性反应 有些微生物具有降解色素的
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能力，也会形成透明圈
ⅴ挑选产生透明圈菌落
ⅵ纤维素酶测定
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
三、实验流程不操作
1、实验流程不操作
ⅰ土壤取样 ⅳ涂布平板：
将稀释度为104～106的菌悬液各取
ⅱ选择培养
0.1 mL，滴加在平板培养基上，用涂布器将 菌液涂布均匀，在30 ℃恒温箱中倒置培养，
ⅲ梯度稀释
至菌落长出。 每个稀释生度命 下需涂布3个平板 注意设置对照
验 选择培养 设 计 纯化培养
增大分解菌含量 染色鉴别
涂布培养 分离出分解菌
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生命
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ⅲ培养基物理性质：固体培养基
ⅳ刚果红染色法 利用此培养基分离筛选出分解能力强的培养基
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生命所系 性命相托
二、纤维素分解菌的筛选
2、培养基设计 【易错提醒】关亍纤维素分解菌筛选的三点提醒
(1)纤维素分解菌的选择培养基中的碳源并丌只有纤维素, 其中酵母膏和水解酪素也可起碳源的作用。
ⅲ梯度稀释
解能力强)
生命
ⅳ将样品涂布到鉴别纤 维素分解菌的培养基上
ⅴ挑选产生透明圈菌落
ⅵ纤维素酶测定
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
三、实验流程不操作
1、实验流程不操作
ⅰ土壤取样 ⅵ纤维素酶测定： 为确定得到的是纤维素分解菌，还需迚
ⅱ选择培养
行发酵产纤维素酶的实验 一般选择对纤维素酶分解滤纸后产
鉴别培养基
特点
允许部分微生物生长, 抑制另一部分微生命生物
生长
使特定微生物的菌 落显示特定的现象
功能 选择、富集微生物
物理性质
液体、固体
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鉴别微生物 一般为固体
生命所系 性命相托
2.3分解纤维素的微生物分离
一、纤维素和纤维素酶
1、纤维素 2、纤维素酶
二、纤维素分解菌的筛选
两种刚果红染色法的比较：
方案一(传统染色法)
方案二
长出菌落的培养基→覆盖CR 配置10mg/mL的CR溶液→
步 骤
溶液→(10~15min后)倒去CR 灭菌→按照1mLCR溶液 溶液→加入1mol/L的NaCl溶 /200mL培养基的比例混匀→ 液→15min后倒掉NaCl溶液 倒平板→接种后培养→出现
2.3分解纤维素的微生物分离
一、纤维素和纤维素酶
1、纤维素 2、纤维素酶
二、纤维素分解菌的筛选
生命
1、实验原理 2、培养基的设计
三、实验流程不操作
1、实验设计不操作 2、案例分析
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二、纤维素分解菌的筛选
1、实验原理 刚果红(RD)染色法 (1)刚果红(RD)
生命所系 性命相托
三、实验流程不操作
1、实验流程不操作
ⅰ土壤取样
ⅰ土壤采集要求 a. 富含纤维素的环境
ⅱ选择培养
b. 取样地事先将滤纸(主成分纤维素) 埋入深度在10cm的土壤中
ⅲ梯度稀释
生命
ⅳ将样品涂布到鉴别纤 维素分解菌的培养基上
ⅴ挑选产生透明圈菌落
ⅵ纤维素酶测定
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