活性氧在海带抗褐藻酸降解菌感染中的作用(开题报告)

活性氧在海带抗褐藻酸降解菌感染中的作用
（为什么要做这个课题？）
海带是我国大型经济海藻养殖的主要对象，养殖历史长，用途广泛。

海带人工育苗是发展我国海带养殖事业的一个重要环节。

但是海带病烂问题严重影响了海带养殖业的健康发展。

海带病烂（烂柄病），尤其在育苗期，将造成很大的经济损失。

氧的某些代谢产物及其衍生的含氧物质都直接或间接由氧转化而成，由于它们都含有氧，而且具有较氧活泼的化学性质，所以统称为活性氧。

活性氧包括含氧自由基和含氧非自由基。

在高等植物中有关活性氧抗感染反应的作用机制已经研究得比较深入。

根据以往的研究报道，当植物体受到病原菌的感染时，往往产生大量的活性氧以抵抗病原菌的入侵。

然而，大量的研究也表明，活性氧往往参加逆境胁迫(盐害、病害、低温、病害和污染等)对植物体的伤害，从而导致植物体抗感染能力的下降，造成病原菌的大量入侵并引起病害的发生。

而对低等植物，如大型海藻，这方面的研究尚未见报道。

褐藻酸降解菌是海带藻体上主要附生细菌，正常情况下由于藻体保持着较高的抗感染能力，限制了褐藻酸降解菌的大量繁殖及其对藻体的侵染，从而在藻———菌间形成一种动态平衡关系，这时并不引起病烂，但若养殖环境恶化，如过于密植、损伤、温度过高等，使海带的抵抗力下降，细菌易于侵入并大量繁殖而导致病害。

（目前国内外研究状况如何（背景））
1.孟琛，肖慧，唐学玺在《褐藻酸降解菌感染海带过程中几种酶的作用比较》中指出，海带在5株褐藻酸降解菌感染的初期（前3天），褐藻酸酶对其单细胞和原生质体的游离率均显著降低，而且随着感染时间的延长，游离率的下降越加明显。

3天过后，随着感染的继续进行，单细胞和原生质体的游离率变化不再明显。

表明海带细胞壁组成对褐藻酸降解菌感染发生了响应性变化，而这种变化仅仅发生在褐藻酸降解菌感染的早期阶段。

研究结果进一步显示，褐藻酸降解菌感染过程中海带细胞壁组成的变化主要体现在褐藻酸的变化上。

2.张培玉，唐学玺，王丽丽，杨震在《活性氧在海带抗褐藻酸降解菌感染中不同时期的抗氧化能力》中指出以海带为材料，研究了活性氧(ROS)在褐藻酸降解菌感染中的产
生及其作用。

结果表明：①褐藻酸降解菌感染引起海带活性氧的大量产生，且海带No 1活性氧的产生速率始终明显大于海带901(P<0．05)。

②在褐藻酸降解菌感染的早期阶段，海带维持着较高的抗氧化能力和对褐藻酸降解菌感染较高的抗性，而且海带的抗感染能力与活性氧产生速率呈一定的正相关性；2个品系相比，海带No．1的抗性又明显大于海带901(P<0．01)。

③在褐藻酸降解菌感染的后期，海带的抗氧化能力显著降低，膜脂过氧化和脱酯化伤害作用加剧，同时对褐藻酸降解菌感染的抗性显著降低，海带的抗感染能力与活性氧产生速率呈一定的负相关性，其中海带No．1活性氧的产生速率、膜脂过氧化作用和脱酯化作用都远远高于海带901；相反，海带No．1对褐藻酸降解菌的抗性明显低于海带901(P<0．05)。

指示在感染的早期阶段，活性氧的产生在海带抵抗褐藻酸降解菌的感染中起着重要作用；而在后期阶段，活性氧的产生又大大降低了海带对褐藻酸降解菌感染的抗性。

海带在感染的早期维持较高水平的抗氧化能力，而在感染的后期抗氧化能力显著下降是活性氧表现出双重作用的重要原因之一。

3.王高歌，王秀良，林伟，严小军，段德麟在《藻类病原体侵染及其防御反应研究进展》（Developmentof defensiveresponsing topathogenirifection inalgae）中指出藻类受到病原体的侵染时，虽然没有免疫体系，但也存在许多反应途径来抵御其侵染。

藻类细胞可在其表面或胞内产生激发子(elicitor)信号，启动一系列防御反应。

虽然该领域研究刚刚起步。

但已取得一定进展。

（本课题要解决一个什么问题（目标）)
1.海带的病烂与褐藻酸降解菌的大量繁殖的关系；
2.本课题以褐藻酸降解菌为病原细菌，研究海带活性氧的产生及其在抵抗褐藻酸降解菌感染过程中所起的作用，以期为揭示海带活性氧的免疫抗感染机制和海带病烂的防治提供依据；
（同行研究的水平，还有哪些问题？本研究的切入点是什么？）
1. 从以往的报道可以看出，有关活性氧免疫抗感染的反应的研究主要集中在高等植物领域。

对高等植物的研究表明，植物体在受感染过程中活性氧的大量产生具有普遍性，不受植物种类和病原微生物种类的限制，而且植物体内活性氧的产生往往发生在抗感染的早期阶段，是植物最早启动的免疫抗感染反应之一。

在低等植物中目前还未见此方面的报道。

2. 在高等植物中有关活性氧免疫抗感染反应的作用机制已经研究得比较深入。

根据以往的研究报道，活性氧在植物免疫抗感染反应中的主要作用机制可归纳为以下几个方面：1）
直接作为抗菌剂。

已证明 O2和H2O2具直接抑菌作用，并且在植株上也得到了初步证实。

2）促进寄主细胞壁结构的增强。

Brisson 等发现被病原菌激发的菜豆和大豆细胞表面产生的过氧化氢驱动细胞壁富含脯氨酸结构蛋白（也富含酪氨酸）的氧化交联，从而使这些蛋白变得不溶。

3）作为被侵染细胞过敏性坏死的局部触发信号。

因为氧化跃变只在非亲和互作中出现，人们不免设想是它导致了过敏性坏死。

Mussel发现无论是外源的，还是由添加的酶和底物产生的H2O2都伤害植物组织，外加的过氧化氢酶阻止这种细胞死亡。

4）作为可扩散的信号诱导邻近细胞防卫机制的启动。

Devin和 Gustine首先观察到活性氧的产生与植保素形成之间的对应关系。

过氧化氢产生体系或过氧化氢都能诱导马铃薯块茎体系植保素的产生。

5）可能参与了系统获得性抗性的建立，植物对病原除表现局部抗性外，另一重要反应是对后侵染的多种病原表现出持久而系统的抗性。

已有研究表明，活性氧参与了系统获得性抗性的建立。

有关大型海藻这方面的研究至今未见报道。

3. 在高等植物中有关活性氧抗感染反应的作用机制已经研究得比较深入。

根据以往的研究报道，当植物体受到病原菌的感染时，往往产生大量的活性氧以抵抗病原菌的入侵。

然而，大量的研究也表明，活性氧往往参加逆境胁迫(盐害、病害、低温、病害和污染等)对植物体的伤害，从而导致植物体抗感染能力的下降，造成病原菌的大量入侵并引起病害的发生。

而对低等植物，如大型海藻，这方面的研究尚未见报道。

4. 本文对低等植物———大型海藻的研究，海带活性氧的大量产生发生在褐藻酸降解菌感染的阶段，褐藻酸降解菌感染阶段活性氧的大量产生的普遍性，与实验选用的不同海带品系和不同褐藻酸降解菌菌株的关系。

褐藻酸降解菌感染阶段活性氧在抗感染反应中的重要作用。

(本课题要解决一个什么问题（目标），预期达到的结果) 本课题以褐藻酸降解菌为病原细菌，通过研究海带活性氧的产生及其在抵抗褐藻酸降解菌感染过程中所起的作用，以期为揭示海带活性氧的免疫抗感染机制和海带病烂的防治提供依据。

（要解决的关键问题是什么）
选择材料，分离褐藻酸酶活性较高的菌株，通过不同品种海带接种不同菌株在不同时期所表现的不同症状，进而判断活性氧在海带抗褐藻酸降解菌感染中的作用。

（针对关键问题拟采取什么样的解决方案）
实验选择日本海带（Laminaria japonica Aresch）的2个品系：海带901（简称901）和荣城1号（简称No.1），分别取自烟台育苗厂和荣城育苗厂，苗体长为 4.0～6.0cm。

同时选用本实验室分离的5个褐藻酸酶活性较高的菌株，二者均为革兰氏阴性，杆状，细胞大小为（0.6～0.7)μm×(1.5～2.4)μm。

按伯杰氏手册将其定为埃氏交替单胞菌（A. espejiana），代号分别为 A1、A2、A3、A4和A5。

用灭过菌的棉球沾取无菌海水擦洗海带小苗反复多次，并经无菌海水冲洗后，置于灭菌培养皿中待用。

取灭过菌的小刀在海带片上划2mm左右的刀口，然后取褐藻酸降解菌悬浮液（浓度为2×10∧7个/mL）2μL接种到海带刺伤处，加入适量的无菌海水并置于无光线直射处静置培养。

在感染的过程中每隔一段时间取划伤部位，用于分析。

活性氧产生的证实采用Ishill的方法。

光合作用的测定采用黑白瓶法，将处理后的藻体(2g)分别放入(500mL)的黑白瓶中，用虹吸的方法充满海水，把所有的空气排出后，将白瓶和黑瓶密闭。

在(10～14)℃光照60μmol/(m2.s)的条件下反应2h，用定氧法分别测定光合前后黑白瓶中溶解氧的浓度。

根据溶解氧浓度的变化、光合时间及藻体的鲜重求出海带的净光合速率。

相对光合速率（%）=（处理组光合速率/对照组光合速率）×100%。

海带对褐藻酸降解菌抗性的大小以下式计算：抗性大小 =（5d时未感染的苗数/总苗数）×100%。

参考文献：
[ 1 ] Ando Y. I noue K. Decomposition of alginic acid by microorganism newly isolated from decaying Laminaria . Jap Scient Fish,1961,27:339-341
[ 2 ] Chen D(陈笃), Lin G-H(林光恒), Shen S-Z(沈世泽) Studies on alginic acid decomposing bacteria.Ⅱ.Rot disease of Laminaria summer sporelings caused by alginic acid decomposing bacteria .Oceanol ET Limnol sin(海洋与湖沼)，1981，12:133-137.(in Chinese with English abstract )
[ 3 ] Ishii S. Generation of active oxygen species during enzymatic isolation of protoplast from oat leaves .In vitro, 1987,23:653-657.
[ 4 ] Averyanov A A. Lapikova V P. Djawakhia V G Active oxygen mediates heat-induced resistance of rice plant to blast disease. Plant Sci, 1993,92:2734.
[ 5 ] Brisson L F. Tenhaken R. Lamb C. Function of oxidative cross-linking of a plant cell wall proline-rich protein: a novel rapid defense response. Cell,1992,70:21-33.
[ 6 ] Baker C J. Orlandi E W Active oxygen in plant pathogenesis.Ann Rev Phytopathol, 1995 33:299-321. [ 7 ] Mussell H W . Endopolygalacuronase: evidence for involvement in verticillium wilt of
cotton .Phytopathol,1973,63:62-70.
[ 8 ] Levine A.Tenhaken D. H2O2 from the oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease resistance response. Cell,1994,79:583-593.
[ 9 ] Devlin W S.Gustine D L Involvement of the oxidative burst in phytoalexin accumulation and the hypersensitive reaction. Plant Physiol,1992,100:1189-1195.
[ 10 ] Neuenschwander U. Vernooij B. Friedrich L. Is hydrogen peroxided a second messenger of salicylic acid in systemic acquired resistance .Plant,1995,8:217-225.
[ 11 ] Ando Y. Inoue K. Decomposing of alginic acid by microorganism newly isolated from decaying Laminaria[J]. Jap Scient Fish, 1961,27:339-341.
[ 12 ] 陈笃.林光恒.沈世泽褐藻酸降解菌的研究Ⅱ.海带夏苗培育中褐藻酸降解菌与烂苗的关系[J]. 海洋与湖沼，1981(02)
[ 13 ] 丁美丽环境因子对褐藻酸降解菌引起海带病烂的影响研究[J]. 海洋学报，1990(02)
[ 14 ] 陈笃.刘秀云.刘秀珍褐藻酸降解菌的研究Ⅲ.海带幼苗培育过程中脱苗和病烂的原因及防治措施[J]. 海洋与湖沼,1984(06)
致谢：感谢老师这个学期给我们带来这门课程，让我系统的了解到了论文的基本写作格式、方法与技巧，对于论文的写作有了一个更好的写作基础；同时老师上课讲的一些道理更是让我受益匪浅，学会更深刻地去分析、思考并去解决问题。