酶联免疫实验手册

酶联免疫
（酶联免疫法检测人血清中甲胎蛋白的含量）
一、实验目的
1、了解酶联免疫吸附实验（ELISA）的基本原理和在生物学领域的实际应用情况。

2、了解几种常见ELISA实验方法的原理和应用范围。

3、了解血清中甲胎蛋白含量测定的原理及意义，掌握其方法。

4、学习酶联免疫吸附实验(ELISA)双抗体夹心法测抗原的原理和方法。

二、实验原理
甲胎蛋白(AFP)是胚胎血清中的一种主要蛋白，属于肿瘤相关抗原，主要由胎肝合成，出生后急剧下降，新生儿在出生后几个月至一年内降至正常水平（20ng/ml）。

AFP为一单一肽链，分子量65000--70000。

正常妊娠中期AFP 含量可达90-500ng/ml。

在畸形妊娠（如：无脑儿、脊柱裂）时，孕妇血清AFP异常升高；当患有原发性肝细胞癌、畸胎瘤时，血清中AFP含量异常升高。

正常人血清中AFP含量低于20ng/ml。

本实验适用于原发性肝细胞癌及胎儿神经管发育异常（脊柱裂、脑积水）的早期辅助诊断。

本实验采用酶联免疫吸附实验(ELISA) 双抗体夹心法来测定血清中甲胎蛋白的含量。

针对甲胎蛋白上不同的抗原决定簇分别制备了两种单克隆抗体，并用以分别制备成包被板和酶结合物。

在包被板中加入标准品、待测人血清后，再加入结合有酶的抗甲胎蛋白单克隆抗体，则标准品和待测血清中的AFP将会与之形成抗体－抗原－酶标抗体复合物。

洗去未结合在上的反应物，加入底物显色剂。

最后在酶标仪下读出每孔的OD值，OD值与AFP含量成正相关。

根据OD值的大小，对照标准的甲胎蛋白标准曲线，即可算出人血清中甲胎蛋白含量。

三、实验器材
甲胎蛋白（AFP）定量测定试剂盒（酶联免疫法）
蒸馏水
待测血清
微量加样器(50ul)及配套枪头
量筒（500mL）
烧杯
胶头吸管
滤纸
水浴锅
酶标仪
四、实验步骤
实验前准备
1、将所有试剂及样本恢复至室温
2、将水浴锅调至反应温度
3、每瓶洗涤液用500ml蒸馏水稀释
步骤
1、加样：将包被孔编号，第1孔作空白对照，其余孔用微量加样器依次加入50ul 标准品（10，20，50，100，200，400ng/ml）、待测血清（加3个孔做平行）和蒸馏水（加2孔做平行，阴性对照）。

随即加入酶结合物50ul（空白孔不加酶），轻轻振荡混匀。

2、温育：置37℃水浴锅温育30分钟。

3、洗涤：甩去孔内液体，用稀释后的洗涤液注满各孔，静置20秒，甩掉，反复5次（每次均需甩净液体），最后在吸水纸上拍干。

4、显色：每孔加底物50ul，立即加显色剂50ul，充分混匀，室温避光反应5分钟。

5、终止：每孔加终止液50ul，终止反应。

五、实验结果
1、酶标仪检测：选择波长492nm，用空白孔校零，在终止反应后的10分钟内测定各孔OD值。

（本实验室酶标仪本身不调零，空白孔也有读数，需要自己在计算时调零，即实验各孔OD值减去空白孔的OD值才为该孔的真正OD值）
2、计算：本试剂盒推荐采用线性回归拟和方式，即以系列标准品浓度值的对数值为横坐标（X轴），以标准品OD值的对数值为纵坐标（Y轴），建立（log-log）标准曲线，计算待测样本的AFP含量。

正常人AFP含量小于等于20ng/ml。

依据标准品含量及其光密度值绘制标准曲线，在标准曲线上查出待测样品的AFP含量。

六、实验注意事项
1、试剂盒在有效期内使用，使用前要充分恢复到室温。

2、严格控制每步反应的加入量、反应时间和温度，操作应紧凑。

3、洗涤要彻底，洗液应注满每孔，每次洗涤均应甩干孔内液体，最后应将孔内液体拍干。

但不可洗涤过猛过急而致假阴性。

4、试剂瓶盖切勿盖错，不同批号的试剂不能混用。

未用完的板条应及时封存于易封袋中。

5、标准品开启使用后，须在1个月内使用，否则应冻存，但应避免反复冻融。

6、待测血清存放于4℃冰箱，采血后24小时内测定。

若需长时间保存，则应冻存于-20℃以下，避免反复冻融。

使用前恢复到室温，轻轻摇动混匀。

若标本有沉淀物形成，应离心除去，并确定未变质方可使用。

溶血或脂血标本不能使用。

7、对AFP含量在20-200ng/ml之间者，建议动态观察。

8、对AFP含量大于200ng/ml的样品，请系列稀释后重做。