第04章 病毒的遗传和变异

第四章病毒的遗传和变异
一、概述
二、病毒的变异现象
三、病毒的变异理论
四、病毒变异的研究方法
五、诱变因素及其诱变机理
主要参考文献
一、概述
遗传与变异是生命的基本特征之一，也是物种形成和生物进化的基础。

病毒遗传学作为微生物遗传学的重要组成部分，对于生物遗传和变异的研究起到了重要的促进作用，也为分子遗传学的发展奠定了基础。

病毒具有结构简单、无性增殖方式、可经细胞培养、增殖迅速、易于纯化等生物学特性，因而是遗传学研究的良好材料。

各种生物遗传的物质基础是核酸，这一结论最初的直接证据正是来自于对病毒的研究。

病毒核酸复制时能够产生完全同于原核酸的子代核酸分子，从而保持其遗传的稳定性。

但是，病毒没有细胞结构，缺乏独立的酶系统，故其遗传机构所受周围环境的影响，尤其是宿主细胞内环境的影响特别深刻；加之病毒增殖迅速，突变的机率相应增高，这又决定了病毒遗传的不稳定性——变异性。

所以，采用适当的选育手段，常可较快获得许多变异株；应用各种理化学和生物学因子进行诱变，也能较快看到结果；而病毒粒子之间以及病毒核酸之间的杂交或重组，又为病毒遗传变异的研究，开辟了广阔前景。

这些便利条件使病毒遗传变异的研究远远超出了病毒学本身的范围，成为人类认识生命本质和规律的一个重要的模型和侧面。

最近几十年来，有关病毒遗传变异机理的认识有了显著的进展。

这不仅是病毒学本身的跃进，也是其它学科，特别是生物化学、分子生物学、免疫学以及电子显微镜、同位素标记等新技术飞速发展的结果。

遗传和变异是对立的统一体，遗传使物种得以延续，变异则使物种不断进化。

本章主要论述病毒的变异现象、变异机理和研究变异的方法，并简要介绍诱变的因素等。

二、病毒的变异现象
病毒的变异，包括许多方面，就表型的改变而言，有毒力变异和抗原变异、培养特性的变异以及对某些理化学因子的抵抗力或依赖性的变异等。

这些变异，不是孤立地独自发生的，而是互相联系和互相影响的，例如毒力不同的毒株，在培养细胞中形成的蚀斑形态也常不同，抗原组成也有所差异。

1.毒力变异
“毒力”表示毒株或毒型间病原性的差异，具体表现为所能感染的动物、组织和细胞范围及其引起的症状、死亡率和病变的程度不同。

2.抗原变异
不同的病毒“型”，实质上就是病毒抗原性的不同。

那些具有许多“型”的病毒，大都也是易于变异的病毒，流感病毒和口蹄疫病毒是其中最显著的例子。

流感病毒的变异，具体表现为表面抗原(血凝素和神经胺酸酶)的变异。

人类甲型流感病毒在过去几十年内曾发生了三次大变异，即抗原转变(antigenic shift)，形成不同的亚型。

而在各次大变异之间，又随时间或地点的不同而出现各种各样的小变异，即抗原漂移(antigenic drift)。

所谓的小变异和大变异，实质上就是由量变到质变的过程。

口蹄疫病毒有7个主型，60多个亚型，抗原性很不稳定，而且应该认为还在不断的演变过程中。

在世界范围内，犬细小病毒2(CPAV 2)是1978年以前的流行株，但在之后的几年中不断发现一种新的变异株CPAV 2a，至1984年 CPAV 2a已成为流行株，随后，新的变异株CPAV 2b又渐渐取代CPAV 2a，至1986年，CPAV 2b又成为新的流行株。

值得注意的是，无论在流感病毒和口蹄疫病毒，或者是在其它病毒，各个型之间往往不能相互免疫，或者缺乏足够的交叉保护力。

实践中经常可以看到的一种现象是：动物耐过某一型病毒感染或者以该型病毒人工接种免疫以后，虽然可对同型病毒呈现坚强的免疫力，但对同种病毒的另一型却不表现抵抗，或者仅有轻度的保护力。

3.培养性状的变异
病毒的“培养性状”，主要是指其在培养细胞上形成的蚀斑的形态和性质。

各种病毒在组织培养细胞上产生的蚀斑性状，除受细胞种类、培养条件等因素影响外，还受病毒变异的影响。

(1)蚀斑的大小：决定于病毒的弥散和吸附率以及病毒复制、成熟、释放的速度和在细胞内外的死亡率等。

蚀斑大小似乎与病毒的毒力呈现一定的平行关系。

一般来说，同一种病毒的小型蚀斑株的毒力低于其大型蚀斑。

这在口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、马脑炎病毒、乙型脑炎病毒、新城疫病毒和多型瘤病毒等可能是个普遍规律——小型蚀斑株对原宿主动物、实验动物和鸡胚的毒力较低。

但是必须指出，某些病毒在组织培养细胞上连续传代后，由于细胞的适应，蚀斑也有逐渐增大的趋势。

因此，蚀斑大小与病毒毒力之间的所谓平行关系，只是相对而言：同一种病毒在相同的培养代数和培养条件下产生的蚀斑，大型蚀斑的毒力一般高于小型蚀斑。

Cooper发现，蚀斑大小的变异与病毒对乙醚的敏感性之间存在着一定联系。

对乙醚不敏感的病毒比对乙醚敏感的病毒更易发生此类变异。

(2)蚀斑的色泽：蚀斑是透明的，还是混浊的?是有色的，还是无色的?这些变化主要决定于蚀斑及其周缘的细胞的死亡与溶崩情况。

有些病毒感染细胞后最终导致细胞崩解，病毒释放，这时产生的蚀斑是无色透明的；有些病毒感染细胞后不导致细胞崩解，通过芽生释放出来，再感染周围细胞，其蚀斑呈白色。

如在蚀斑中存留较多的活细胞，则可能因着染中性红而使蚀斑呈红色。

这样的红色蚀斑已经见于腺病毒、新城疫病毒和一个SV病毒变异株。

(3)蚀斑的形状：蚀斑是圆的还是不规则的?蚀斑边缘是清晰的，还是弥散的?这与病毒的弥散率及其导致的细胞病变率有关。

同一种病毒于相同条件下通常产生性状一致的蚀斑。

因此，蚀斑性状的改变，常被视作病毒变异的一个重要指标，而蚀斑选种也就成为挑选病毒变异株的一个重要方法。

如在性状相同的大多数蚀斑中，出现少数几个与众不同的蚀斑，即可认为是变异株。

当然，其中某些可能只是暂时的、非遗传的蚀斑变异，将其于组织培养细胞中传代时，常可恢复其原来的典型蚀斑性状。

4.重组现象
指两个不同性状的病毒株在混合感染时，由于基因组某个或某些片段的交换，形成新的基因组合而出现“杂交”性状的子代病毒。

重组最先发现于噬菌体，随后在痘病毒、流感病毒、脊髓灰质炎病毒和呼肠孤病毒等多种动物病毒中观察到。

一般来说，同种病毒的不同毒株之间容易发生重组，但重组也可发生于不同种和不同群病毒之间。

5.互补现象
同种(株)或异种(株)许多病毒粒子在混合感染同一细胞时，可能发生干扰现象，即一种(株)病毒的增殖抑制或干扰另一种(株)病毒的增殖。

但也可能发生另一种情况：一种(株)病毒的增殖促进另一种(株)病毒的增殖，甚至为另一种(株)病毒增殖所必需。

这一现象称为互补(complementation)。

6.表型混合
混合感染时由一种病毒的核酸与另一种或另一株病毒的衣壳(和囊膜)组合而成的病毒粒子，这一现象称为衣壳交换。

衣壳交换常见于细胞培养物混合感染几株不同的肠道病毒(例如脊髓灰质炎病毒和柯萨奇病毒)时。

表型混合病毒的衣壳也可能是杂合的，就是由两种(株)病毒蛋白亚单位混合构成(见图4-1)。

在流感病毒等有囊膜病毒，当两型病毒(例如甲型和乙型流感病毒)混合感染同一细胞，由于都在胞膜上出芽获得囊膜，可能具有两型病毒的囊膜突起。

图4-1 病毒的表型混合
除上述变异情况外，病毒还有对温度、化学药剂以及营养等因素的变异。

突变是可逆的，通常把野生型到变异型的突变称为正突变(forward mutation)，而将由变异型向野生型的突变称为回复突变(back mutation)。

一般来说，RNA病毒的变异性不如DNA 病毒稳定，容易发生回复突变。

三、病毒的变异理论
关于病毒的突变理论，存在着两种观点。

一种认为，突变是随机自由发生的，病毒基因组上任何位置随时都在出现突变，因此就一种病毒的克隆来说，均存在一些具有突变的病毒粒子，RNA病毒比DNA病毒更为明显。

在动物机体或细胞内环境的选择性作用下，占优势的病毒粒子得以存活并遗传下来，形成最初分离到所谓的野生型。

当环境条件改变后，某些具有突变的更适合生存的克隆被选择出来，形成所谓的突变型，因此实际上野生型和突变型只是相对而言的。

另一种观点认为，病毒的突变与细菌对不易感动物体适应相似，是病毒在新的生活条件下，借合成途径的某些改变而发生，正如前面所述的病毒对某些化学药物的抵抗或依赖那样。

说明除突变和环境因素的选择性作用外，病毒可能还有真正的适应性变异。

现在从分子生物学水平上探讨病毒核酸的正常和异常配对情况。

H与邻近N或O原子的氢键结合，是碱基配对的基础。

据此，在DNA复制过程中，腺嘌呤与胸腺嘧啶配对，而在转录或RNA复制过程中，腺嘌呤与尿嘧啶配对；鸟嘌呤则与胞嘧啶配对。

这些特异性配对通常是严格地执行的，如图4-2所示。

但是核酸碱基的结构又允许H原子从一个原子向另一个邻近原子转移，从而可能发生不同的碱基配对，例如胸腺嘧啶中的N3上的一个H原子可能转移到C-4上，从而改变C-4的酮基为烯醇基，并改变碱基配对，以致胸腺嘧啶可能与鸟嘌呤而不是腺嘌呤配对。

鸟嘌呤同样地也可发生酮式—烯醇式变化。

N1氢转移至C-6氧上，从而使鸟嘌呤可与胸腺嘧啶配对，如图4-2所示。

图4-2 病毒核酸中嘌呤和嘧啶的正常氢键结合
图4-3 胸腺嘧啶的异常的碱基配对
病毒核酸分子中一个嘌呤被另一个嘌呤替代或一个嘧啶被另一个嘧啶替代的过程，称为碱基转换(transition)。

而一个嘌呤被一个嘧啶替代或一个嘧啶被一个嘌呤替代的过程，称为碱基颠换(transversion)。

碱基转换和碱基颠换总称为碱基置换(substitution)。

由于转换和颠换影响一个核苷酸，故其引起的突变称为点突变(point mutation)。

病毒基因组的突变还有缺失(deletion)和插入(insertion)，分别表示DNA或RNA分子中
减少或增加一个或几个碱基乃至更长的序列。

如果缺失或插入的碱基数目为3n±1，则影响到读码框架的改变，称为移码突变(frameshift mutation)。

由于病毒是最小的生命单位，其基因组中和遗传信息已高度压缩，存在基因重迭现象，因此发生的突变多为碱基置换，而缺失、插入等较大的改变往往引起基因组结构的巨大变化，甚至导致病毒死亡，在实践中这样的病毒不常见到。

研究病毒的突变主要是对碱基置换而言。

但在下述的人工突变研究中，则可人为地造成大段的核苷酸序列缺失或插入等。

除了上述碱基置换、缺失和插入外，重组(recombination)是病毒变异的另一个主要原因。

两个病毒株的病毒核酸发生重组的机理是，首先发生断裂，随后断裂部分相互交换，如图4-4所示；在基因组呈多片段的病毒，例如呼肠孤病毒，重组是某个或某些核酸片段的交换，结果是在一个衣壳内包含有来源自两个不同亲代的核酸片段，如图4-5所示。

图4-4 重组：两个病毒之间的部分核酸交换
图4-5 重组：两个病毒之间的核酸片段交换
特别值得指出的是，基因组复制过程中经过反转录阶段的反转录病毒，重组发生的机理有其自己的特点。

反转录病毒基因组的重组需要一个病毒复制周期，其间两个不同的母源RNA基因组的RNA 分子装配到同一个病毒粒子内，产生异质性颗粒，在感染新宿主细胞后，两个RNA(或至少部分)经反转录酶拷贝为DNA，重组即发生于这一阶段。

关于反转录病毒基因组同源重组的机理有两个模型：
(1) 强迫拷贝-选择模型(forced copy choice model)：这一模型由Coffin提出，即在由RNA模板合成负链DNA的过程中，因模板转换而形成重组反转录病毒DNA分子(图6-
6A)。

由于断裂部位是随机的，若在每一个裂隙处均发生模板链转换，则一个完整的DNA分子负链就由片段性模板复制而来。

(2) 链置换-同化模型(strand displacement assimilation model)：这一模型认为重组是由于病毒正链DNA交换。

具有两个RNA基因组的异质性病毒粒子内的两条RNA均复制为负链DNA，然后以RNase H酶切基因组RNA正链产生的RNA引物，在多位点起始合成正链DNA。

新形成的DNA正链开始时短而不完整，且有单链裂隙，随着正链DNA合成，裂隙被填平，但当遇到邻近正链的5'端时，DNA合成不能终止，而是5'端链被继续合成所取代，形成单链尾部。

当这些尾部侵入病毒中第二条基因组上正在合成中的DNA时，形成“H”结构，最终导致形成含异质性区域的双链分子(图4-6B)。

图4-6 反转录病毒的两个基因重组模型
四、病毒变异的研究方法
研究病毒的遗传变异，首先必须对其进行纯化。

如果原始毒种本来就较混杂，或者已有许多变异病毒存在其中，那就容易产生假象，难以发现规律性的东西。

其次，要有客观的鉴定指标和方法，以便正确地判定病毒特性的改变情况。

1.病毒的纯化
通常所谓的“纯系”病毒，亦即克隆株(clone)，其实也是一个或几个病毒粒子的许多子代的群体，而在这些群体中可能又出现了新的变异，尤其是RNA病毒。

但因原种数量占绝对优势，在表现性状上仍可视其为纯系。

动物病毒的纯系分离，亦即纯化，主要应用4种方法：（1）蚀斑分离法；（2）病斑分离法；(3)终点稀释法；(4)细胞克隆法。

2.遗传指标
鉴定病毒遗传变异特性的常用指标包括：①病毒粒子的形态；②抗原构造及血清学性状；
③蚀斑或病斑的大小和性状；④致细胞病变(CPE)的特征；⑤病原性，包括感染范围和毒力；
⑥对理化学因素的抵抗力；⑦对干扰素的敏感性。

3.研究方法
研究病毒的遗传变异，包括几方面的内容：从整体水平上研究病毒的突变率，即某病毒基因组一次复制过程中某一核苷酸位点因置换、缺失或插入而改变的可能性；根据某一遗传学指标(见上述)，从自然流行毒株中筛选或结合应用诱变因素筛选有意义的变异株；分析变异株突变的性质；通过人工突变研究某一位点(或区域)的改变对病毒遗传性状的影响。

下面分别加以叙述。

(1) 病毒突变率研究：确定病毒突变率的方法有多种。

首先，最直接的方法是体外测定病毒基因组复制酶的错配率，如水疱性口炎病毒(VSV)RNA聚合酶的错配率为10-3.15 ，但在体内聚合酶的错配率可能要更低一些；其次，病毒突变率可根据由一个纯化克隆衍生而来的病毒基因组群体中核苷酸置换的频率估计出来；或者由同一蚀斑衍生而来的大量病毒克隆的直接序列分析测定出来，后两种方法或许不能精确地反映病毒突变率，因为某些突变是致死性的，而且传代次数不易确定。

除直接测定序列外，也可通过以下方法间接获得病毒的突变率：①从一个病毒克隆株中呈现特定表型的变异株出现的频率估计突变率。

温度敏感性生长特性、蚀斑形态学、宿主范围以及致病性等表型受几种基因上不同突变的影响，显然不适于进行突变率的研究，不过，如果突变株及其回复突变株的突变性质清楚的话，某一表现型改变的变异株的回复突变频率可用于测定碱基置换率。

Bos和Nayak(1986)测出一个流感病毒ts- 变异株的突变率为10-3.5，Morita等(1987)报道了4个VSV ts- 变异株的突变率分别为10-3.5、10-3.6、10-4.0和10-4.9；②测定野生型病毒克隆中抵抗病毒复制抑制剂的变异株出现的频率以估计病毒突变率。

Pincus 等(1986)测得脊髓灰质炎病毒胍抵抗性变异株出现的频率为10-7.4和10-6.7之间，该突变表型需要2个独立的突变，说明核苷酸置换率为10-3.7～10-3.4；③测定克隆中抵抗中和性单克隆抗体的变异株出现的频率，这是报道应用最多的方法。

不同病毒因不同方法测定的突变率各不相同。

例如，用单克隆抗体测定的流感病毒RNA 置换频率约为10-6，而根据ts- 变异株回复突变以及直接序列分析相关的克隆RNA确定的结果为10-4；同样地，VSV中和作用抵抗变异株出现的频率比VSV ts-变异株回复突变率(10-3.5～10-4.9 )或直接序列分析VSV基因组RNA核苷酸置换获得的突变率(10-3.7)低10～100倍。

相反，直接分析脊髓灰质炎病毒克隆测定的置换频率(〈10-5)比胍抵抗性变异株出现频率和中和作用抵抗性变异株出现频率低10～100倍。

但无论怎样，应用同一种方法可以评价不同病毒的相对突变率。

有关DNA病毒突变率的资料较少，但似乎与RNA病毒相类似。

单纯疱疹病毒(HSV)的中和作用抵抗性变异株的突变率为≥10-5，犬细小病毒的中和作用抵抗性变异株的突变率为10-3.4 和10-5.4之间。

(2) 人工筛选变异株：在动物病毒变异研究中最具有实际意义的是获得毒力低，而仍保持免疫原性的弱毒株，也就是针对病毒致病性这一遗传学指标进行研究。

动物病毒的许多毒力变异株是人工培育的结果，概括起来有以下几种减毒方法：
①异种动物适应性变异: 医学及兽医学上许多弱毒疫苗株就是利用通过自然条件下不感染或不易感染的所谓异种动物这个途径获得的。

将强毒株转移到新宿主(一般常用实验动物)，开始时往往不引起或仅引起轻微的感染症状(或病变)。

但是随着传代次数的增加，症状或病变逐渐增剧，甚至引起典型的发病、死亡。

而此时往往减低了对其原宿主的毒力。

例如猪瘟兔化弱毒株，就是多代通过兔体，在增高对兔体毒力的同时减低了其对原宿主(猪)毒力的猪瘟病毒株。

同样，兔化牛瘟毒株、鼠化和兔化口蹄疫毒株、鼠化马瘟毒株等也都是适应于异
种动物的典型例子。

②异常感染途径适应性变异: 将病毒通过非正常感染途径接种，也可达到使毒力致弱的目的。

朱既明等在将森林脑炎病毒株对乳鼠进行连续的脑内接种传代后，在腹腔或皮下注射时的毒力逐步降低，传代40次后，皮下注射基本上不能致病。

黄热病病毒也有这样的例子，泛嗜性黄热病病毒经小鼠脑内连续接种传代后变为嗜神经性，泛嗜性消失，非脑内接种时不再呈现病原性。

③鸡胚适应性变异: 30年代发展起来的鸡胚培养技术，对病毒培养和弱毒疫苗株的培育起了巨大的推动作用，至今它仍然是病毒学研究的常规技术之一。

鸡胚化牛瘟病毒株、鸡胚化乙型脑炎毒株、胚化狂犬病毒株等都曾成功地用作疫苗毒株。

④细胞适应性变异: 40年代发展起来的组织细胞培养技术成为病毒研究中的重要方法，也是目前应用于弱毒株筛选中的主要手段。

例如乙型脑炎病毒经仓鼠肾细胞、鸡胚成纤维细胞传代后，对人及家畜的毒力明显下降；麻疹病毒经鸡胚成纤维细胞传代后对人的毒力下降等；犬肝炎病毒通过猪肾细胞培养，牛瘟病毒通过绿猴肾细胞培养，也都获得了弱毒株。

应用同种动物细胞，例如将猪瘟病毒和牛腹泻—粘膜病病毒分别在猪白细胞培养物和牛肾细胞中传代，也获得了弱毒株。

但因敏感细胞缺乏选择性，病毒粒子不纯。

故以敏感细胞培育的弱毒株，应再以蚀斑法或终点稀释法进一步纯化。

必须指出的是，某些病毒的感染范围很窄，即使应用上述多代“强迫”接种方法，仍难适应在异种动物或细胞中增殖，当然无法应用这一手段达到减毒目的。

⑤ts- 变异株和低温适应株的培育: 由于ts- 变异株和低温适应株的毒力一般都较原毒株低。

因此，应用诱变剂选育ts- 变异株以及应用低温培养方法培育低温适应株，已是实验室内取得弱毒株的一个重要手段。

这类变异株常可通过诱变剂处理同时进行适当选育的方法获得。

在已经接种病毒的细胞培养物中加入亚硝酸、盐酸羟胺或5-溴脱氧尿核苷和2-氨基嘌呤作诱变剂，虽然绝大多数病毒此时已经灭活，但仍可能残存少数病毒保持活力，这些病毒在上述诱变剂的作用下发生突变经过一定程度的增殖之后，即有可能从中选育出ts- 突变株。

例如Sambrook等(1966)应用5-溴脱氧尿核苷和2-氨基嘌呤作诱变剂，加入已经接种兔痘病毒的鸡胚成纤维细胞的维持液中，再经蚀斑选育，获得只能在34.5℃(称为允许温度)而不能在39.5℃(称为非允许温度或限制温度)增殖的突变株；Williams(1971年应用亚硝酸、羟胺和5-溴脱氧尿核苷等作诱变剂，育成了40个腺病毒ts- 突变株，可在31℃生长，但不能在38℃增殖；Pringle(1971)在培养液内加入5-氟尿嘧啶，随后作蚀斑分离，由881个VSV克隆株中选育出9个稳定的ts- 变异株，这些ts- 变异株可在31℃增殖，但不能在40℃增殖。

目前已在流感病毒、口蹄疫病毒、新城疫病毒、水疱性口炎病毒、腺病毒、呼肠孤病毒、脑炎病毒和多型瘤病毒等多种病毒中，通过类似方法获得了ts- 变异株。

⑥重组试验: 不仅是研究病毒遗传学，特别是了解病毒基因的排列组合及其与表现性状之间的关系等的一个重要手段，也是培育或创造新毒株的一个有效途径。

实验室内的重组试验常在培养细胞或鸡胚中进行。

亲本株必须尽可能纯化，而且两个亲本株之间至少需要具有两个以上的性状差别。

将两个亲本株混合感染培养细胞或鸡胚以后，收获子代病毒，并作纯系分离，选育其中具备两个亲本株“杂交”性状的新毒株，即为重组型。

例如一个重组型流感病毒可以具有来源自一个亲代病毒株的血凝素和另一个亲代病毒株的神经氨酸酶。

Tumova等(1965)应用活的甲2型流感病毒和紫外线灭活的鸡瘟病毒混合感染鸡胚组织培养细胞，获得一株具有鸡瘟病毒蚀斑形成能力和甲2型流感病毒不耐热血凝素特性的重组型病毒，此株病毒同时含有上述两种病毒的株特异性抗原。

熊光明用口蹄疫病毒(FMDV)和猪肠道病毒(EV)混合感染IBRS-2细胞，经过适当的筛选、克隆，鉴定了一个具有FMDV和EV抗原特性的重组病毒株。

(3) 突变性质的分析：。