组氨酸标签人β干扰素在EcoliBL21（DE3）中的表达,纯化和活性测定

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2011.01.004 ·
论著· 组氨酸标签人β干扰素在
E. coli BL21(DE3)中的表达、纯化和活性测定
王丽非，朱元军，王松梅，杜郁，余腾斐，王丽，洪斌
【摘要】
目的在大肠杆菌中高效表达组氨酸标签与人β干扰素融合蛋白，并进行蛋白纯化和生物活性测定。

方法提取人 Bel-7402 细胞总 DNA 为模板，经 PCR 获得人β干扰素编码基因片段。

将此基因插入表达载体pET-16b，重组克隆，经酶切与测序确认后转化至大肠杆菌BL21(DE3)，进行 IPTG 诱导表达和条件优化。

表达产物经Western blotting 分析，用 Ni sepharose 亲和层析纯化，纯化产物进行干扰素生物学活性测定。

结果经表达条件优化后，SDS-PAGE 显示重组菌株表达与组氨酸标签人β干扰素分子量大小一致的条带，进一步的 Western blotting 分析中发现表达的蛋白能与人β干扰素抗体及组氨酸标签抗体产生结合反应，亲和层析纯化分离得到纯度 92% 的组氨酸标签人β干扰素，干扰素生物学活性测定表明，获得的组氨酸标签人β干扰素比活性为4.2 × 107 U/mg。

结论组氨酸标签人β干扰素编码基因在大肠杆菌中成功表达。

建立了该蛋白的简便亲和纯化方法，表达产物具有人β干扰素生物学活性，为进一步以此系统表达及纯化其他具有生物学活性的科研用标签化细胞因子奠定了基础。

【关键词】干扰素β；重组融合蛋白质类；基因表达
中国医药生物技术, 2011, 6(1):12-17
干扰素（interferon，IFN）是一种具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等活性的细胞因子，能通过多种机制影响肿瘤细胞功能，促进免疫细胞的活性[1]。

干扰素是一个大的基因家族，可分为 3 型，主要包括 IFNα、IFNβ和 IFNγ[2]。

IFNβ主要用于病毒性疾病、恶性肿瘤和自身免疫性疾病的治疗[3]。

1993 年，美国 FDA 批准了 Chiron 公司生产的IFNβ-1b 上市销售，其商品名为 Betaseron，用于治疗多发性硬化症、神经系统疾病。

日本也批准了静脉注射的 IFNβ用于治疗慢性乙型或丙型肝炎[4]。

尽管如干扰素、集落刺激因子等一些细胞因子已被开发成蛋白药物用于临床，但作为科研用试剂的细胞因子的开发在我国几乎是一片空白，高价进口和受制于西方生物技术公司成为细胞因子来源的主要现状。

本工作在国家科技支撑计划——“科研用细胞因子试剂平台的完善和应用研究”的支持下，采用高效的宿主系统和载体表达标签化细胞因子——组氨酸标签人β干扰素（HIS-IFNβ），实现了可溶性表达，并利用 Ni sepharose 亲和层析的方法，分离得到高纯度的 HIS-IFNβ，并进行了生物学活性的检测，为科研用标签化细胞因子试剂的研制奠定了基础。

1 材料与方法
1.1 主要材料与仪器
1.1.1菌株、细胞株、病毒株和质粒大肠杆菌E. coli TG1、E. coli BL21(DE3) 为本实验室保存；人羊膜细胞（Wish细胞）购自中国科学院上海细胞中心；水泡性口膜炎病毒（VSV）为本研究所保存；质粒载体 pGEM-T 购自美国 Promega 公司；质粒载体 pET-16b 购自美国 Novogen 公司。

1.1.2 培养基大肠杆菌培养基 LB 的配制参见分子克隆操作指南[5]；氨苄青霉素在 LB 培养基中使用浓度为 100 μg/ml；Wish 细胞所用 MEM 培养基购自美国 Thermo scientific 公司。

1.1.3工具酶和生化试剂限制性内切酶、T4 DNA 连接酶等均购自日本 TaKaRa 公司；Pfu DNA 聚合酶购自上海生物工程公司。

TA 克隆试剂盒，购自美国 Promega 公司；UNIQ-10 柱式 DNA 胶回收试剂盒，购自上海生物工程公司。

人β干扰素抗体和组氨酸标签抗体购自美国 R&D 公司；
基金项目：国家科技支撑计划（2006BAF07B01，2009BAK61B04）；国家自然科学基金（30973668）；北京市自然科学基金（5102032）
作者单位：100050 北京，中国医学科学院医药生物技术研究所卫生部抗生素生物工程重点实验室（王丽非、朱元军、王松梅、杜郁、余腾斐、王丽、洪斌）；100191 北京大学药学院（朱元军）
通讯作者：洪斌，Email：*********************
收稿日期：2010-10-12
人β干扰素标准品购自中国药品生物制品检定所。

1.1.4 仪器 MiniCycle TM PTC-200 型 PCR 仪为美国 MJ Research 公司产品；SEMI-DRY TRANSFER 转膜仪为美国 Bio-Rad 公司产品；ÄKTA Explorer 系统为美国 GE Healthcare 公司产品；SHIMADZU-20A 型高效液相色谱仪为日本岛津公司产品；C8 反相柱 ZORBAX 300SB-C8为美国 Agilent 公司产品。

1.2 方法
1.2.1 人β干扰素与组氨酸标签融合蛋白重组表达菌株的构建PCR 扩增、DNA 电泳及片段回收、大肠杆菌质粒提取和转化、质粒酶切和连接等DNA 基本操作参见分子克隆操作指南[5]。

提取人Bel-7402 细胞总 DNA 作为 PCR 扩增的模板，设计一对引物（5’ TCCATATGATGAGCTACAACTTG CTTGG 3’ 和5’ CGGGATCCTTAGTTTCGGAGGT AACCTGTAAG 3’），采用Pfu 高保真 DNA 聚合酶进行 PCR 扩增。

为确证 PCR 扩增得到的片段为正确的相关基因，将 PCR 产物电泳后进行胶回收纯化，3’ 端加A，克隆到 pGEM-T 载体上，得到重组质粒 pGEM-IFNβ。

将重组质粒转化至 E. coli TG1 感受态细胞，挑取白斑，提取其中的重组质粒进行Nde I 和Bam HI 双酶切鉴定。

鉴定正确后，琼脂糖凝胶电泳回收Nde I 和Bam HI 双酶切片段和同样经过上述酶切回收的载体 pET-16b 进行连接，转化 E. coli TG1，在含有 Amp 100 μg/ml 的 LB 琼脂平板上挑选转化子。

转化子提质粒进行酶切鉴定，鉴定正确的重组表达质粒命名为pET16b-IFNβ。

将重组表达质粒转化E. coli BL21 (DE3) 感受态细胞，获得重组表达菌株E. coli BL21 (DE3)/pET16b-IFNβ。

1.2.2 组氨酸标签人β干扰素在大肠杆菌中表达条件的摸索为了使重组蛋白在细胞裂解液上清中表达量最大化，本工作进一步优化了重组菌株表达的 IPTG 诱导时间、浓度和温度。

将菌株E. coli BL21(DE3)/pET16b-IFNβ接种于 5 ml LB 培养基，37 ℃培养过夜，取 1 ml上述菌液，转种50 ml LB 培养基 37 ℃培养，待菌液 OD600约为0.6 ~ 1.0 时，以不同浓度的 IPTG 诱导 8 h，取1m l菌液收集菌体，进行聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分析。

取上述 OD600约为 0.6 ~ 1.0 时的菌液，在 0.08 mmol/L IPTG 诱导条件下37 ℃ 分别培养1、2、3、5、6、7、8 h，取 1 ml 菌液收集菌体，进行 SDS-PAGE 分析。

取上述 OD600约为 0.6 ~ 1.0 时的菌液，在 0.08 mmol/L IPTG 诱导条件下分别在 37 ℃和 28 ℃培养 6 h，取1 ml 菌液收集菌体，破碎细胞，分别取上清、沉淀进行 SDS-PAGE 分析。

1.2.3 Western blotting 分析取菌株 E. coli BL21(DE3)/pET16b-IFNβ发酵液，收集菌体，破碎细胞，取上清进行 SDS-PAGE 后，取出凝胶放置于转膜缓冲液中，用 Bio-Rad semi-dry transfer 转膜仪进行蛋白印迹转移，根据凝胶面积按0.65 mA/cm2 电转移至 PVDF 膜。

转膜完毕后，将膜用丽春红 S 溶液浸泡 5 min，再用水漂洗脱色，以确认目标条带是否成功转移到 PVDF 膜上。

然后将膜放入杂交袋，加入含 5% 脱脂牛奶的 TBS，4 ℃封闭过夜。

弃封闭液，加入用 5% 脱脂牛奶稀释（1:1000）的一抗（人β干扰素抗体或抗His-tag 抗体），室温缓慢振荡 2 h。

弃抗体，将膜以 TBS 漂洗 3 次，每次 5 min，加入用 5% 脱脂牛奶稀释（1:1000）的碱性磷酸酶标记的马抗小鼠 IgG(H+L) 作为二抗，室温缓慢振荡 2 h。

将膜放于 TBS 液中漂洗 3 次，每次 5 min 后，膜置于碱性磷酸酶显色底物 NBT/BCIP 溶液中，室温显色至特异性杂交条带出现，将膜取出放置于去离子水中终止显色。

1.2.4 组氨酸标签人β干扰素纯化重组表达菌株在最适条件下进行培养，收集菌体，菌体用binding buffer 悬浮，置于冰浴中进行超声破碎，直至无明显菌体。

10 000 × g离心 10 min，收集上清，0.45 μm 滤膜过滤备用。

采用 ÄKTA Explorer 系统，将过滤后的样品上样至以 5 倍体积 binding buffer（0.02 mol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，0.01 mol/L 咪唑，pH 8.0）平衡的His Trap FF crude 亲和柱，以 elution buffer（0.02 mol/L Tris-HCl，0.5 mol/L NaCl，0.25 mol/L 咪唑，pH 8.0）进行梯度洗脱，UV 280 nm 检测收集目的蛋白峰。

将含有目的蛋白的洗脱液合并，充分透析后冷冻干燥存储。

1.2.5 高效液相分析重组蛋白纯度将纯化的重组蛋白样品进行 HPLC 分析，采用岛津SHIMADZU-20A 仪器，C8 反相柱，流动相A：20% 乙腈，流动相B：0.1% 三氟乙酸（TFA），连续梯度洗脱，在 30 min内乙腈浓度由 20% 增至80%，流速为 1 ml/min。

记录产物峰面积，并计算表达产物的纯度。

1.2.6 人β干扰素生物学活性测定参照 2005
年版《中国药典》第三部附录中干扰素生物学活 性测定法，依据细胞病变抑制法，将培养于含 10% 小牛血清的 MEM 培养基中的Wish 细胞生长 24 ~ 48 h 时配成细胞浓度约为 3 × 105 个/ ml 的悬液，加到 96 孔细胞培养板上，每孔 100 μl 。

同时设立标准品对照。

在含 5% CO 2，37 ℃ 孵箱中培养 4 ~ 6 h 后，每孔加入 4 倍系列稀释的干扰素样品 100 μl ，样品稀释用含 7% 小牛血清的 MEM 培养液，37 ℃ 培养 18 ~ 24 h 。

弃上清后用含 3% 小牛血清 MEM 培养基稀释 VSV 至 100 TCID 50 进行攻击，然后于含 5% CO 2，37 ℃ 孵箱中培养 24 h 左右。

弃掉培养板中的上清液，每孔加入 50 μl 的结晶紫液室温染色 30 min ，弃掉染液，用自来水冲洗残余的染液，用滤纸吸干后每孔加入 100 μl 的脱色液脱色，在 Bio-Rad 自动酶标仪上于 570 nm 波长处测定每孔的吸收值（OD ），记录测定结果，将数据结果按照四参数回归计算法进行处理，以标准品为参考，并根据下列公式计算待测样品活性。

样品生物学活性（U/mg ）= P r ×
r
s E E P r ：标准品生物学活性，U/mg ；
E s ：样品相当于标准品半效量的稀释倍数； E r ：标准品半效稀释倍数。

2 结果
2.1 人 β 干扰素与组氨酸标签融合蛋白重组表达载体的构建及表达菌株的获得
人 β 干扰素的编码序列存在于一个外显子上，提取人 Bel-7402 细胞总 DNA 作为 PCR 扩增的模板进行扩增，得到预期大小的 PCR 产物（图 1A ）。

PCR 产物进行序列测定，测序结果与 GenBank 数据库进行 Blast 比对和分析，表明获得的片段序列与已知人 β 干扰素的基因序列完全一致。

本工作采用质粒 pET-16b 作为表达载体，将人 β 干扰素基因克隆至载体组氨酸标签编码序列之后，可表达组氨酸标签与人 β 干扰素的融合蛋白。

将人 β 干扰素基因片段克隆至载体 pET-16b ，提取转化子质粒进行酶切鉴定，获得与 PCR 扩增的基因大小一致的片段（图 1B ），表明人 β 干扰素基因成功插入了 pET-16b 质粒。

将获得的重组表达质粒命名为 pET16b-IFN β。

将重组表达质粒转化 E. coli BL21(DE3) 感受态细胞，获得重组表达菌株 E. coli BL21(DE3)/pET16b-IFN β。

M 1
M 1
2
A B
A ：M ：Trans 2K DNA 分子量标准；1：IFN β 的 PCR 产物
B ：M ：λDNA/Hin dIII 分子量标准；1 ~ 2：pET16b-IFN β 经 Nde I 和 Bam HI 双酶切
A: M: Trans 2K DNA marker; 1: PCR fragment of IFN β. B: M: λDNA/Hin dIII marker; 1 - 2: pET16b-IFN β/Nde I + Bam HI.
图 1 IFN β 的 PCR 扩增和 pET16b-IFN β 的酶切验证 Figure 1 PCR product of IFN β and restriction enzymatic analysis of pET16b-IFN β
2.2 组氨酸标签人 β 干扰素的表达
2.2.1 组氨酸标签人 β 干扰素表达的 IPTG 诱导浓度、时间和温度的摸索 以不同浓度的 IPTG 诱导 8 h ，SDS-PAGE 结果表明在 0.08 mmol/L IPTG 诱导条件下表达量最高，增加 IPTG 诱导浓度表达量无明显增加（图 2A ）。

在 0.08 mmol/L IPTG 诱导条件下分别诱导不同时间，SDS-PAGE 结果表明诱导 6 h 后，表达量已经达最大，以后没有明显增加（图 2B ）。

分别在 37 ℃ 和 28 ℃ 培养下进行诱导表达，SDS-PAGE 结果表明在 28 ℃ 培养下，表达产物存在于细胞裂解液上清中更多（图 2C ）。

最终确定最优表达条件为，0.08 mmol/L IPTG 诱导下，28 ℃ 培养 6 h 。

2.2.2 Western blotting 检测 表达的组氨酸标签人 β 干扰素蛋白分子量约为 20 kD ，N-端带有 His-tag ，分别用抗His-tag 抗体和人 β 干扰素特异性抗体进行 Western blotting 检测。

在约 20 kD 处有一明显杂交条带（图 3），表明该特异条带为组氨酸标签人 β 干扰素蛋白。

2.3 组氨酸标签人 β 干扰素蛋白的纯化
将组氨酸标签人 β 干扰素表达菌株 E. coli BL21(DE3)/pET16b-IFN β 在最适条件下发酵，采用 HisTrap FF crude 亲和柱纯化，收集目的蛋白，梯度透析，冷干。

每升发酵液可获得 28.2 mg 纯化后的组氨酸标签人 β 干扰素蛋白（图 4）。

将纯化的蛋白样品进行 HPLC 分析，检测其纯度，结果显
kD M 1 2 3 4 5 6 7 8kD M 1 2 3 4 5 6 7 8
94
62
40
30
20
12
A 94
62
40
30
20
12
B
kD M 1 2 3 4 5 6 80
60
40
30
20
12
C A：M：蛋白质低分子量标准；1：BL21(DE3)/pET-16b 的发酵产物；2 ~ 8：重组菌株 BL21(DE3)/pET16b-IFNβ分别用0.05、0.08、0.16、0.32、0.64、0.8、1 mmol/L 的 IPTG 诱导后 8 h 的发酵产物
B：M：蛋白质低分子量标准；1：BL21(DE3)/pET-16b 的发酵产物；2 ~ 8：BL21(DE3)/pET16b-IFNβ用 0.08 mmol/L IPTG 诱导1、2、3、5、6、7、8 h 后的发酵产物
C：M：蛋白质低分子量标准；1：BL21(DE3)/pET-16b 的发酵产物；2：37 ℃培养后 BL21(DE3)/pET16b-IFNβ的全菌裂解液；3：37 ℃培养后BL21(DE3)/pET16b-IFNβ的包涵体；4：37 ℃培养后 BL21(DE3)/pET16b-IFNβ裂解液上清；5：28 ℃培养后 BL21(DE3)/pET16b-IFNβ的包涵体；6：28 ℃ 培养后 BL21(DE3)/ pET16b-IFNβ裂解液上清
A: M: Low range molecular weight marker; 1: BL21(DE3)/pET-16b; Lane: 2 - 8: BL21(DE3)/pET16b-IFNβ induced for 8 hours by 0.05, 0.08, 0.16, 0.32, 0.64, 0.8, 1 mmol/L IPTG.
B: M: Low range molecular weight marker; 1: BL21(DE3)/pET-16b; 2 - 8: BL21(DE3)/pET16b-IFNβ induced for 1, 2, 3, 5, 6, 7, 8 h by 0.08 mmol/L IPTG. C: M: Low range molecular weight marker; 1: BL21(DE3)/pET-16b; 2: Whole cell lysate of BL21(DE3)/pET16b-IFNβ induced at 37 ℃; 3: Inclusion body of BL21(DE3)/pET16b-IFNβ induced at 37 ℃; 4: Cellular lysate supernatant of BL21(DE3)/pET16b-IFNβ induced at 37 ℃; 5: Inclusion body of BL21(DE3)/pET16b-IFNβ induced at 28 ℃; 6: Cellular lysate supernatant of BL21(DE3)/pET16b-IFNβ induced at 28 ℃.
图 2HIS-IFNβ在大肠杆菌 BL21(DE3) 中的表达
Figure 2 The expression of HIS-IFNβ in E. coli BL21(DE3)
1 2 3 kD
20
A
20
B
A：His-tag 抗体检测；B：IFNβ抗体检测；1：BL21(DE3)/pET-16b 的发酵产物；2 ~ 3：BL21(DE3)/pET16b-IFNβ的发酵产物
A: His-tag antibody; B: IFNβ antibody; 1: Cellular lysate supernatant of BL21(DE3)/pET-16b; 2 - 3: Cellular lysate supernatant of BL21(DE3)/ pET16b-IFNβ.
图 3 Western blotting检测HIS-IFNβ的表达
Figure 3 Western blotting analysis of the expression of HIS-IFNβ
kD M 1 2 3 4
118
90
50
34
26
19
M：蛋白质预染分子量标准；1：BL21 (DE3)/pET16b-IFNβ全菌裂解液；2：BL21 (DE3)/pET16b-IFNβ裂解液上清；3： BL21 (DE3)/pET16b-IFNβ包涵体；4：纯化后的HIS-IFNβ
M: Prestained molecular weight marker; 1: Whole cell lysate of BL21 (DE3)/pET16b-IFNβ; 2: Cellular lysate supernatant of BL21(DE3)/pET16b- IFNβ; 3: Inclusion body of BL21(DE3)/pET16b-IFNβ; 4: HIS-IFNβ after purification.
图 4 HIS-IFNβ蛋白的纯化
Figure 4 Purification of HIS-IFNβ
图 5HPLC 检测 HIS-IFNβ的纯度
Figure 5HPLC analysis of purified HIS-IFNβ
示组氨酸标签人β干扰素的保留时间为 11.5 min，纯度为 92%（图5）。

2.4 组氨酸标签人 β 干扰素蛋白生物学活性测定
参照 2005 年版《中国药典》第三部附录中干扰素生物学活性测定法，结果经干扰素β国家标准品（2008 国生标字 0015）校正，确定其比活性为 4.2 × 107 U/mg。

3 讨论
作为科研用的细胞因子试剂，其应用领域主要为生命科学领域的遗传学、发育学、细胞学、免疫学、生物化学和分子生物学，基础医学与药学等，并包括了相应的应用性开发研究。

为了增加科研用细胞因子试剂的示踪性、可检测性及其稳定性，进一步完善、拓展科研用细胞因子试剂的特性，扩展其用途，使其逐步向高端产品方向迈进，我们进行了标签化细胞因子（tag-细胞因子）试剂的研制，现已表达了多种标签化的细胞因子。

标签化细胞因子不仅可方便细胞因子试剂本身的分离纯化，利用此功能，还可方便地进一步分离和研究其受体或与其相互作用的分子，可提高基础研究的效率和水平。

同时，不仅其本身能作为普通的科研用细胞因子试剂，而且可作为研发临床诊断试剂的重要的中间核心物质，具有潜在的诊断试剂特性。

本工作采用大肠杆菌表达系统中常用的E. coli BL21(DE3)，该宿主是以 T7 RNA 聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。

载体 pET-16b 在大肠杆菌中可以快速而有效地表达重组蛋白，它利用 T7 启动子和终止子进行高效表达，并可在表达蛋白 N 端加上组氨酸标签，便于表达产物的纯化。

而且在组氨酸标签后加上凝血酶 Xa 的酶切位点，便于纯化产物后将组氨酸标签切除，利于产物的后续处理。

本工作结果表明在此系统中可成功表达带有组氨酸标签的人β干扰素，每升发酵液可获得 28.2 mg 纯化后的组氨酸标签人β干扰素蛋白。

表达的融合蛋白既能与组氨酸标签抗体产生结合反应，又可与人β干扰素抗体产生结合反应。

利用 Ni sepharose 亲和层析纯化，从大肠杆菌的上清中分离得到纯度 92% 的细胞因子。

干扰素生物学活性测定也表明，获得的组氨酸标签的人β干扰素具有人β干扰素生物学活性，比活性为 4.2 × 107 U/mg。

本工作为进一步以此系统表达其他科研用标签化的细胞因子奠定了基础。

参考文献
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via type I interferon. Curr Opin Immunol, 2002, 14(4):432-436.
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Expression and purification of HIS-IFNβ fusion protein in E. coli BL21(DE3)
WANG Li-fei, ZHU Yuan-jun, WANG Song-mei, DU Yu, YU Teng-fei, WANG Li, HONG Bin
【Abstract】
Objective To express and purify the fusion protein HIS-IFNβ of human interferon β (IFNβ) and His-tag in E. coli BL21(DE3). Methods IFNβ gene was obtained from the total DNA of human Bel-7402 cell by PCR. IFNβ gene was then inserted into prokaryotic expression vector pET-16b and transformed into E. coli BL21(DE3). The expressed product was purified by affinity
chromatography using Ni-NTA column and its antigenicity was analyzed by Western blotting analysis. The specific biological activity was detected by standard survival activity test on Wish cells challenged with VSV virus.
Results SDS-PAGE result indicated HIS-IFNβ was expressed at the right molecular weight after induced by IPTG. Western blotting test showed the protein had reaction with either IFNβ monoclonal antibody or His-tag antibody. The purity of HIS-IFNβ purified by affinity chromatography reached 92% and the specific activity was about 4.2 × 107 U/mg.
Conclusions The fusion protein of human interferon β with His-tag was successfully expressed and purified in E. coli BL21(DE3). The bioactivity of the fusion protein has been identified by cell anti-virus test.
【Key words】 Interferon-beta; Recombinant fusion proteins; Gene expression
Author Affiliations: Department of Bioengineering, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China (WANG Li-fei, ZHU Yuan-jun, WANG Song-mei, DU Yu, YU Teng-fei, WANG Li, HONG Bin); Peking University School of Pharmaceutical Science,Beijing 100191, China (ZHU Yuan-jun)
Corresponding Author: HONGBin,Email:*********************
Chin Med Biotechnol, 2011, 6(1):12-17
·行业动态· 借力“十二五”产学研联盟促生物医药发展
作为一种更高级的合作形式，以企业为主体、以市场为导向的创新联盟，搭建了稳定、持续的产学研合作平台。

随着中国医药市场的快速增长，在国际医药市场的排名和比重越来越靠前，以及中国政府“十二五”规划把生物医药作为支柱产业的倾向性支持，业界对于中国生物医药发展的前景寄予更多想象。

而在 12 届上海国际生物技术与医药研讨会上，产学研联盟重新回归讨论焦点：一场以“构建创新联盟，促进产业发展”为主题的研讨会人气十足，政府、院所、企业展开深入对话。

“自去年 8 月进行生物推介会后，上海生物医药产业有了很大进展。

”上海市科学技术委员会生物医药处副处长郑忠民展现了过去一年上海生物医药产业的闪亮成绩单：行业经济总量增长，2009 年增长率达到 17.2%。

2010 年 1 ~ 8 月经济总量 882.75 亿元，保持 15% 以上的增长率；重点企业得到快速发展，行动规划中的 100 家企业的增长率达到 27.2%，明显高于全市平均水平；重点产品明显增加，2012 年计划打造 100 个过亿产品，2009年已达到 55 个；招商引资及产业化成效显著，从 2009 年 8 月到 2010 年 7 月，上海六大基地共引入 267 个招商项目达 330 多亿元，正式签约的有 175 个，涉及金额 181 亿元。

郑忠民指出，目前上海的产业集群态势初步形成，企业回流明显，生物医药和医疗器械是产业发展的主要增长点，他还特别强调：“以企业为主体的产学研创新联盟正式启动，大家的思路正在转变，技术联盟必须回归企业需求。

”
产学研联盟的回归也源于国家层面的推动。

在 2009 年 12 月 5 日的中央经济工作会议上，温家宝总理提出，要加快构建以企业为主体、市场为导向、产学研结合的技术创新体系。

而相关部门在诠释“十二五”规划时，也强调“要把增强自主创新能力与完善现代产业体系结合起来，充分发挥科技创新对产业优化升级的驱动作用，强化企业在技术创新中的主体地位，引导资金、人才、技术等创新资源向企业集聚，推进产学研战略联盟，提升产业核心竞争力”。

有专家认为创新联盟可以解决过去传统的产学研合作方式短期、分散、稳定性差的问题。

作为一种更高级的合作形式，以企业为主体、以市场为导向的创新联盟，搭建了稳定、持续的产学研合作平台。

同传统的产学研合作方式相比，创新联盟可以通过共同投资、合作研发来避免重复投资，降低创新成本；通过产学研各方的优势互补、信息共享选择最优创新路径；通过集中攻关、上下游联动提高创新效率，缩短从技术到工艺到产品的旅程，所以容易催生更多更好的创新成果。