[知识]石油降解细菌的分离提纯及简单应用

石油降解细菌的分离提纯及简单应用
内容简介：
“油田采出水”，也称“油田污水”。

油田污水中不仅含有原油，还溶进了地层中各种盐类、悬浮物、有害气体和有机物,BOD5/ COD Cr 值仅有0. 15～0. 3 左右。

在原油处理时还掺进了大量高分子化学药剂，形成一种特殊的难降解的有机废水。

就此状况及特点，及目前应用于含油废水处理的各种生物处理方法，以及生物处理的原理表明，高效原油降解菌和生物处理构筑物相结合的生物深度处理技术是国内油田污水处理技术发展的趋势。

随着生物处理技术的不断发展，越来越多的生物处理方法被应用于油田污水的处理,并获得了良好的处理效果。

关键词：高效降油菌、石油污染土壌、接种、提纯、生物修复
正文：
随着石油工业的发展，含油废弃物的污染范围不断扩大，污染程度也日益严重，对其进行治理有着重要的现实意义。

80年代以来，污染土壤的生物修复技术由于具有费用省、操作简单和环境影响小的特点，越来越受到关注, 并得到广泛应用。

土壤中广泛分布着可降解石油的微生物种,它们在土壤生物修复中具有重要作用，但是数量上相差很大。

土壤中降解石油微生物的数量与污染物的存在有着密切关系。

它们能够适应环境,然后进行选择性富集并发生遗传改变，从而导致烃类降解细菌所占比例及编码降解烃类基因的质粒数量增加。

有报道指出，降解烃类的微生物一般只占微生物群落总数的不到1 %，而当有石油污染物存在时,降解者的比例增加到10 %。

此方法基本实现对不同污染程度、不同类型的污染修复的相应处理手段，研究结果为含油废弃物的土壤异位生物修复技术的实用化提供了试验依据。

优质石油降解细菌的培养筛选方法
菌种的采集：被石油污染的土壤中的细菌
培养基：NH4NO32g ， K2HPO41. 5g， KH2PO43g，MgSO4·70H2O 0. 1g，无水CaCl20. 01g，Na2EDTA·2H2O 0. 01g，原油1g，蒸馏水: 1000mL，pH值7. 2～7. 4.
操作方法（即石油降解菌的富集、分离、纯化）：取一定量的石油污染土样接入装有100mL 培养基的250mL 三角瓶中，于30℃、160 rmin- 1条件下在摇床中培养7d，然后取一定量的上述培养液接入装有100 mL
新鲜培养基的250mL三角瓶中， 30℃、160 r·min- 1条件下摇床中培养7d;如此共3次。

用接种环沾取富集培养液于平板上划线，经过多次划线纯化后，将纯化菌株于试管斜面培养后保存于冰箱。

石油降解菌的复筛：称取含油土样50g，溶于经灭菌的培养基100mL 中，配成泥浆，盛于250mL 的三角瓶中，在无菌条件下，将制好的菌悬液接种2mL于三角瓶中，各菌种均做3个平行样，并作加氯化汞杀菌和不加菌2种空白对照。

在30℃、160 r·min- 1条件下于摇床中培养。

每2d 取1次样，测其石油烃含量,直至其石油烃含量不再有明显变化，筛选出石油烃降解率高的菌种。

接种量影响试验的操作方法与菌种复筛的方法相同。

不同的是改变接种量和试验土样。

样点1、样点2、样点3、样点4的泥浆中石油烃浓度分别为125mg·L - 1、56 mg·L - 1、3245mg·L - 1、209 mg·L – 1。

石油降解菌的生物修复：称取含油土样2kg于圆形瓷盆中，将斜面培养的细菌进行活化，与锯末(1∶7,质量比)制成固体培养基，接入石油污染土壤中。

土壤含水率基本保持在20%左右,在自然温度下进行修复。

实验的基本结果
1、高效降油菌的筛选：
为了取得高效、彻底的生物修复效果,分离和筛选污染物的高效降解菌种是生物修复的必然要求。

试样经过3次富集培养以及分离纯化等步骤得到多个单菌株。

在此基础上,采用降解石油试验，复筛出7株对石油具有较高降解能力的菌株。

细菌密度可达107 ～109个·mL - 1，株菌可以利用石油为唯一碳源生长。

培养7d后的生物除油率为43. 8%～58. 9% ，高于一般石油降解菌对石油类的降解率（ 25. 8% ～32. 8% ）对所筛选的7株菌进行生理生化试验表明，这可能是由于革兰氏阴性菌细胞外层是脂多糖,而脂多糖是由脂类和多糖组成的复合物，可以为细胞提供一个既亲水又亲油的两亲分子层，这一方面使其细胞与油滴表面接触，使石油烃易于进入细胞，另一方面，它能降低水- 油界面张力，使原油变为由细小油滴构成的乳剂，并扩散进入细胞,加速油的降。

2、高效降油菌对石油的降解能力试验中设置了加氯化汞杀菌对照试验和不加菌的空白对照试样。

实验表明，加氯化汞的杀菌试样石油烃降解率为9%的水平，随着降解时间的延长石油烃降解率基本不变，最高为12%。

加氯化汞杀菌试样中石油烃减少的主要原因为石油烃挥发和空气氧化的作用。

不加菌和氯化汞对照试样2d后的降解率为11% ，降解率随时间的延长逐渐增加，降解8d后37%的石油烃被去除，与氯化汞杀菌试样相比有25%
的石油烃是在土壤本身存在的微生物的作用下去除。

接种上述提存后的菌种的试样在2d后即开始表现较强的降解能力，其降解率达到50%左右。

与不加菌对照试样相比37%左右的石油烃是被高效菌降解利用，表明分离得到的株菌能很快适应环境发挥高效除油能力。

且加菌试样的石油烃降解率曲线变化趋势基本一致，降解率随着降解时间的延长逐渐增加。

泥浆为微生物生长提供了良好的环境，降解8d后加菌试样的降解率均达到80%左右，远高于不加菌试样的降解（37%）。

3、高效降油菌细胞平均降解速率
研究表明，高效降油菌接种量对是对不同土壤除油率影响的主要因素。

实验表明接种菌液量越大，石油菌的数量越多。

通过增大接种量可以提高土壤中石油菌的数量，同时高的接种量有利于石油烃的降解。

除油率随着接种量的增加而增大，表明高的接种量可以增强接种菌与土著微生物的竞争能力，使接种菌迅速适应环境，大量繁殖，发挥高效降解能力。

4、高效降油菌对石油污染土壤的生物修复试验研究
根据国内外大量的研究报道，许多环境因素均对接种高效降油菌的除油效果产生影响。

实验中表明，没有投加任何细菌的石油土壤中的石油基本上没有降解，而一般含有降解细菌的石油土壤的降解率是37%，而含有较强的降解率的石油细菌则较高，约85%。

即：投加高效菌株可在较短的时间内将土壤中的石油污染物去除。

可见保持土壤中较高的降油菌数量是实现生物修复的关键。

5、石油降解菌在环境领域的应用
针对油田含油污水这种难降解处理的工业废水，高效原油降解菌和生物处理构筑物相结合的生物深度处理技术应该是国内油田采出水处理技术发展的趋势。

曝气生物滤池组合工艺法：曝气生物滤池处理污水的原理是反应器内填料上所附生物膜中微生物氧化分解作用，填料及生物膜的吸附阻留作用和沿水流方向形成的食物链分级捕食作用以及生物膜内部微环境和厌氧段的反硝化作用，从而除去水中的油类物质。

MBR —BAF 法（膜生物反应器—曝气生物滤池）：膜生物反应器作为一种新兴高效的污水处理技术已引起了国内外水处理界的高度重视，它实现了超滤膜的高效过滤和高浓度活性污泥生物降解的有机结合，而且不需要二沉池和污泥回流系统,在运行成本、能耗以及处理效果等方面均具有优势。

田慧颖等采用MBR —BAF 系统处理辽河油田的采油污水,系统对采油污水中的油、BOD5 、氨氮去除效果很好，
去除率均可达到90 %左右，COD 的平均去除率也可达到70 %以上，出水清澈透明,无异味。

含油泥砂生物法处理：含油泥砂是油田开发过程中产生的重要污染源之一，油泥砂含有大量原油，对周围的大气、水质和土壤会造成严重的污染生物处理法利用微生物将泥砂中的原油污染物降解为CO2和H2O ，实现无害化处理。

微生物具有分布广、数量多、代谢类型多样和适应突变能力强的特点，在任何存在污染物的地方都会出现相应的可降解污染物的微生物,利用经过驯化、筛选、诱变或基因重组等获得的高效降解菌种来处理污染物，与物理化学方法相比，具有安全性好，无二次污染，易于管理等优点，因此日益受到国内外环保界的视。

总结
随着我国石油工业的发展，受石油污染土地的面积不断扩大，污染程度也日益严重。

这些污染物质毒性大，有的有致癌致突变作用，进入土壤后难以去除，而且会随着径流进入周围的流域和地下水，从而给油田及周围的生态环境带来了严重的环境问题。

石油污染的生物修复技术由于生产费用低、不产生二次污染而被视为一项具有广阔前景的高新技术。

向石油污染土壤中投加环境适应强、降解效能高的菌种或菌群是提高石油污染土壤生物修复效率的主要手段。

但污染土壤的微生物修复是一项涉及污染物特性、微生物生态结构和环境条件的复杂系统工程，分离提存高效的石油降解细菌及它的工程应用必定成为生物及环境界的热点。

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