CAF的分泌组学在免疫联合疗法中的应用

-2802-中国免疫学杂志2020年第36卷doi：10.3969/j.issn.1000484X.2020.22.023
CAF的分泌组学在免疫联合疗法中的应用①
张梦琰石然何敬东(南京医科大学附属淮安第一医院，淮安223300)
中图分类号R730.51文献标志码A文章编号1000-484X(2020)22-2802-07
［摘要］癌相关成纤维细胞(CAF)是肿瘤微环境中最丰富的细胞群，在肿瘤进展中起着至关重要的作用。

CAF在肿瘤微环境中能分泌一些趋化因子，如IL$、Chi3L1、SDF-1、CXCL12,这些因子通过旁分泌作用促血管生成、肿瘤侵袭及转移。

这些因子不仅影响肿瘤免疫，还在肿瘤微环境中协助肿瘤细胞进行免疫逃逸，从而促进肿瘤进展和免疫耐受等。

近年来，免疫检查点抑制剂在部分肿瘤晚期患者中应用，取得了较好的临床效果，部分患者得以长期存活。

因此,靶向肿瘤微环境中特定的分泌因子与免疫检查点抑制剂联合应用,成为了研究的热点。

本文综述了CAF的分泌组学及生物学功能的研究进展，并阐述其临床应用前景和面临的现实挑战。

［关键词］癌相关成纤维细胞;分泌组学;趋化因子;免疫治疗;联合治疗
Application of secretory omics of CAF in immune combination therapy
ZHANG Meng-Yan,SHI Ran,HE Jzng-Dong.The Affiliated Huaian No.1Peaple's Hospital of Nanjing Medical University,Huaian223300,China
[Abstract]Cancer-associated fibroblasts(CAF)are the most abundant cells in tumor microenvironment and play a crucial role in tumor progression.CAF can secrete some chemokines in tumor microenvironment，such as IL-6，Chi3L1，SDF-1and CXCL12，which promote angiogenesis，tumor invasion and metastasis through paracrine.These factors not only affect tumor immunity，but also assist tumor cells in immune escape in tumor microenvironment，thus promoting tumor progression and immune tolerance.In recent years，im- munocheckpoint inhibitors have been used in some patients with advanced tumor，and achieved good clinical results，and some patients survived for a long time.Therefore，targeting specific secretory factors in tumor microenvironment and the combined application of immu­nocheckpoint inhibitors has become a research hotspot.In this paper，the research progress of secretory omics and biological functions of CAF are researched，and the clinical application prospect and realistic challenges are expounded.
[Key words]Cancer-associated fibroblasts；Secretory omics；Chemokines；Immunotherapy；Combination therapy
肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)是一个复杂的组织环境,包括细胞外基质(extracellular matrix,ECM)和各种类型的基质细胞,如巨噬细胞、炎性细胞、癌症相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts,CAF)和间充质干细胞［1-4］。

CAF作为肿瘤微环境中最丰富的细胞群，在癌症行为中发挥着重要作用［5-7］。

从起源和生物学功能来看，CAF是一群具有细胞异质性的群体，主要来源于肿瘤所驻留或募集的间充质细胞。

它们靠近癌细胞和其他基质成分周围，如免疫细胞、血管⑷。

一般状态下成纤维细胞主要是静止的，仅在组织重塑和修复期间
①本文为江苏省研究生科研创新计划(KYCX18_1504)。

作者简介：张梦琰，女，硕士，主要从事肿瘤免疫学方面的研究，E-mail:zhangmengyan_njmu@。

通讯作者及指导教师:何敬东，男，医学博士，主任医师，副教授，主
要从事消化系统肿瘤方面的研究，E-mail：
hjddoctor@。

获得短暂的活性。

一旦其被激活,它们要么凋亡，要么恢复到休眠状态;否则，会出现组织纤维化和慢性炎症等病理现象。

这种慢性的组织修复反应与癌症的发展有关［9］。

1CAF的来源与功能
1.1CAF的生物标记物由于CAFs的来源复杂,常需要联合使用多种生物学标记物对其进行鉴定。

其中，琢-SMA和FAP是两种最常用的CAF标记物,但这两个标记物并不能精准地划分CAF亚群［l0］o 因此,后来有许多逐渐被证实的其他标记物,如波形蛋白、成纤维细胞特异性蛋白-1(fibroblast-specific protein-1,FSP1)和血小板源生长因子(platelet-derived growth factor receptor-茁，PDGFR0)等［11］。

因此,CAFs形成了一些表达多种分子标记的异质性细胞亚群，但这些标记不一定是成纤维细胞所特有的。

1.2CAF的生物学功能CAF在调节肿瘤细胞行为中起着重要作用,它通过诱导癌细胞的干细胞样
张梦琰等CAF的分泌组学在免疫联合疗法中的应用第22期•2803•
特性和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)参与肿瘤的发生，帮助癌细胞逃避免疫监视，在肿瘤进展和治疗耐药性中发挥着重要作用［l2-l4］。

几项转录组学和免疫组织化学的研究表明，成纤维基质成分与患者预后不良有关,可以用 于预测治疗的反应及疗效［l5-l8］。

最近的一些报道表明，CAFs通过分泌CXCL12信号和募集骨髓来源抑制性细胞来调节肿瘤浸润淋巴细胞(tumor­infiltrating lymphocytes,TILs)［l9,20］。

在体外模型中,通过荧光素酶定量分析发现实验组Colon26-luc+ NIH/3T3(小鼠成纤维细胞系)的荧光信号比对照组Colon26-luc+强(P<0.05)，且实验组CD8+TILs数量远远低于对照组。

结果表明，CAFs通过调节肿瘤内组织TILs，加速肿瘤免疫抑制，促进肿瘤的进展［2l，22］。

2CAF的分泌组学
CAFs可以分泌各种细胞因子以及降解ECM的蛋白,靶向到肿瘤部位,从而对肿瘤微环境的形成和肿瘤的进展起着重要的调节作用⑺，24］。

所有的微环境成分中特别是CAF,通过分泌细胞因子，如MMP9、TGF0、CXCL12、IL-6等，在肿瘤生长和转移中起着重要作用［25-28］。

它们的作用包括在癌细胞周围形成结构基质,有利于各种肿瘤异质性的形成,如上皮-间质转化，并刺激可降解邻近组织的蛋白酶的产生，从而促进肿瘤发展、侵袭和转移［29］。

2.1生长因子CAFs可以分泌表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等，它们介导细胞增殖、抗凋亡活性、细胞骨架重排和细胞侵袭［30-32］。

2.1.1成纤维细胞生长因子肿瘤相关成纤维细胞分泌FGFs,如FGF-1和FGF-3,可促进肿瘤发生［33］。

从人结肠癌组织分离出的CAFs与NFs培养上清中，发现FGF-1和FGF-3的mRNA和蛋白水平升高，而其他生长因子，如FGF-2和FGF-7没有明显差别。

FGFR4是FGF-1和FGF-3的受体，随着FGF-1和FGF-3分泌水平增高，导致了FGFR4的磷酸化。

FGFR4激活后，随后启动下游信号通路蛋白丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MEK)和细胞外信号调节激酶1/2 (extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)，调节金属蛋白酶(MMP-7)的表达，并伴有过度血管生成和细胞增殖,促进结直肠癌细胞的生长。

这些观察表明，CAF加速了结直肠癌的发生。

抑制FGF信号具有抗增殖和抗血管生成的作用，可能为结肠癌的治疗提供一种有用的策略［34］o然而，由于现有研究规模往往较小且结果相互矛盾，FGF-2过表达在实体肿瘤中的预后价值仍然存在争议。

基于FGF-2研究现状，将18项不同研究中2975例实体瘤患者的生存数据进行了系统评估［35］o分析表明FGF-2表达与各种实体肿瘤的不良预后相关,FGF-2是一种有价值的预后指标。

推测FGFR2可能是一个新的治疗靶点。

2. 1.2血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor A，PDGF-A)PDGF能促进各种类型细胞的生长和存活，促进间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)的增殖。

PDGF亚型是不同类型间充质细胞的重要有丝分裂原，这些亚型刺激细胞的增殖、存活和分化［36］。

PDGF-BB是一种约30kD的二聚体蛋白，属于血管内皮生长因子家族。

它可以激活PDGF-A和PDGF-B受体，诱导多种生物学功能。

PDGF-BB可保护多种类型细胞不发生凋亡，促进细胞周期进程和增殖［37,38］。

胆管癌是一种影响胆道的高度恶性肿瘤,其特征是有丰富的基质，包括CAF,能促进早期转移扩散。

胆管癌衍生的PDGF-D刺激成纤维细胞分泌血管生长因子。

因此，靶向成纤维细胞或PDGF-D诱导信号可能是阻断肿瘤相关淋巴管生成和降低胆管癌侵袭性的有效工具。

PDGF-D通过促进癌细胞的增殖和侵袭性、成纤维细胞的募集和活化以及异常的细胞外基质沉积，在促进肿瘤生长方面发挥着多种作用［39］o
2.1.3肝细胞生长因子HGF是一种主要来源于CAFs的细胞因子，参与了许多实体肿瘤细胞的表型调控［40,41］。

在肿瘤行为中，HGF与肿瘤细胞上的c-Met(一种HGF酪氨酸激酶受体)形成信号通路,介导了肿瘤的增殖、转移、血管生成［42,43］。

在大量癌症患者的CAFs样本中，EGFR TKI耐药组患者的HGF表达水平明显高于对照组，CAFs分泌的HGF 可以诱导EGFR TKI耐药。

此外，EGFR抑制剂和HGF受体抑制剂的联合治疗可能对分泌大量HGF 并伴有EGFR突变的患者有改善作用［44］o另外, HGF靶向治疗可能是治疗其他肿瘤的一种途径。

已有研究表明，抗HGF在肺腺癌亚群中具有临床应用价值［45］。

在相关研究中，病理标本和原位肝转移模型表明，过表达CD44与结直肠癌(colorectal cancer,CRC)转移有关。

CRC来源的成纤维细胞
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(colorectal cancer-cancer-associated fibroblasts，CC-CAFs)通过上调CD44增加了CRC的黏附和迁移,促进肝或肺转移。

与正常成纤维细胞相比,CAFs分泌的HGF增加了10倍。

HGF通过HGF/c-MET信号通路上调CD44,介导癌细胞与内皮细胞黏附，进而导致CRC转移增强。

HGF可作为一种新的治疗或预防靶点。

2.2趋化因子趋化因子是指能够吸引白细胞移行到感染部位的一些低分子量(多为8~10kD)蛋白质，在炎症反应中具有重要作用，如白介素家族IL-1a.IL-1p.IL-6等。

IL-6是一种炎症细胞因子，IL-6蛋白和其mRNA被发现在患有乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌和结肠癌的人类和小鼠的血清中上调，在TME中通过JAK/STAT、MEK、AKT等信号通路参与肿瘤发生、增殖、侵袭、血管生成和肿瘤免疫抑制等过程［46］。

从临床样本和小鼠样本发现, CAFs是IL-6的主要来源。

在体内模型中，通过调节IL-6的表达水平，显著增加了肿瘤的生长。

进一步对肿瘤微环境中免疫细胞的浸润分析，发现CD8+ T细胞浸润减少，但MDSC加快分化，表明高水平IL-6在肿瘤微环境中破坏T细胞功能，从而引起免疫抑制现象。

IL-6和PD-L1联合阻断可在HCC小鼠模型中发挥作用，延长生存期。

在临床试验中，PD-L1免疫检查点表现出一定的耐药性。

然而，在肝癌和胰腺癌模型中，当联合IL-6阻断时，抗PD-L1的耐药性完全逆转［47,48］o IL-33是IL-1家族的细胞因子，不仅在内皮细胞、上皮细胞中表达，在成纤维细胞也有表达［49,50］。

在肺癌、胃癌和肝癌患者中均检测到血清IL-33水平升高。

CAFs分泌IL-33后，通过激活EMT,参与了肿瘤的侵袭和转移［51］。

2.3蛋白酶类在过去的几十年里，CAF的研究取得了一定的进展。

CAF分泌了一系列蛋白，如MMP2、MMP9、尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase­type plasminogen activator,uPA),在肿瘤发生、转移和免疫抑制TME中发挥着重要作用。

其中,uPA是肿瘤转移的重要指标，它由CAFs分泌。

靶向uPA 的药物正在进行临床前研究,但对于临床应用还需要广泛的研究。

2. 3.1基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)MMPs是一个由24个人类锌结合内肽酶组成的家族，它可以降解几乎所有的ECM成分，释放和激活许多细胞功能调节剂，成为癌症进展和侵袭等不同阶段的中心调控因子［52］o CAF通过分泌MMP，女口MMP2、MMP3、MMP9等，促进ECM的侵袭并渗入血液和淋巴管系统［53］o越来越多的体外研究、小鼠模型和人类临床研究表明,MMPs在肿瘤生长、血管生成和转移等癌症进展的所有阶段中都具有一定意义。

目前已知，不同的MMP在癌症进展的不同阶段可能具有相反的作用，或产生不同的效果［54,55］。

因此，一些MMPs被认为是“药物靶点”，而另一些则被认为是癌症治疗的“反向靶点”［56］。

2. 3.2壳多糖酶3样蛋白1(Chitinase-3-like protein1,Chi3L1)Chi3L1在人类中也被称为YKL-40，约40kD大小，是一种高度进化保守的分泌蛋白［57］。

含有保守的几丁质酶样结构域,但缺乏几丁质水解酶活性，由多种细胞表达。

Chi3L1在多种疾病中都有上调现象,包括慢性炎症、纤维性疾病和各种癌症［58］。

研究发现,人源及鼠源的CAF上清中，Chi3L1均高度上调。

在体内模型中，对CAF 中Chi3L1的基因敲除,减缓了肿瘤生长及巨噬细胞的募集，增强了CD8+和CD4+T细胞对肿瘤的浸润,促进了Th1表型［59］。

CAF来源的Chi3L1介导了肿瘤中成纤维细胞和免疫细胞之间的一个新的信号轴，从而驱动免疫抑制，促肿瘤微环境生长。

综上所述，成纤维细胞来源的Chi3L1是基质细胞复杂的相互作用中一个新的关键分子,促进肿瘤进展和转移,并提示靶向Chi3L1可能对癌症有治疗作用,Chi3L1可能在CAFs的促肿瘤活性中发挥作用，未来可以作为预防及治疗的良好标靶。

2. 3.3C型凝集素结构域家族3成员(C type lectin domain family3member B，CLEC3B)CLEC3B是C 型凝集素超家族成员，在细胞中负责编码四联素并存在于各种内分泌组织、上皮细胞和间充质细胞，包括成纤维细胞、单核细胞和中性粒细胞中。

在大多数癌症类型中，血浆CLEC3B水平一致降低，但在肿瘤组织和肿瘤间质组织中有不同的分布模式及表达情况［60,61］。

在乳腺癌中，CLEC3B主要表达在胞浆,而在其他肿瘤中，CLEC3B的表达主要或完全局限于肿瘤间质。

CRC间质中只有CLEC3B表达较强,正常结肠黏膜中很少或没有表达。

研究进一步采用ELISA法分析了8对CRC来源的CAFs和NFs的细胞上清液，发现CAF上清液中CLEC3B的分泌水平明显高于NFs对照组上清液。

IHC结果显示，CRC 肿瘤间质中CLEC3B的表达水平明显高于邻近正常组织。

此外,通过对93个组织样本的临床病理特征的分析，表明CLEC3B水平与肿瘤发生密切相关(P=0.009)o皮尔森分析揭示，琢-SMA(CAF的常用生物标记物)和CLEC3B之间呈正相关性，高表达a-SMA与患者低生存率相关［62］。

2.4外泌体外泌体是由脂质双分子层组成的微
张梦琰等CAF的分泌组学在免疫联合疗法中的应用第22期•2805•
小囊泡，并含有多种生物活性成分，包括DNA、microRNAs、蛋白质和脂质。

外泌体可由多种细胞分泌，如肿瘤细胞、基质细胞等,调节血管生成、细胞侵袭和转移［⑻。

肿瘤细胞分泌外泌体可以促进血管渗透性、塑造转移微环境和介导化疗耐药,而基质细胞也通过外泌体的分泌增强肿瘤细胞的恶性表型⑹，65］。

具体来说,CAFs可以通过外泌体介导细胞通讯，增加肿瘤细胞中的microRNAs，如miR-92a-3p、miR-105及功能蛋白Snail、CD81等的表达，破坏内皮屏障，促进癌症生长、侵袭、转移及耐药性屜阿。

靶向microRNAs或功能蛋白可能是一种新的治疗策略。

3靶向分泌因子与传统免疫抑制剂联合治疗肿瘤
免疫疗法，特别是免疫检查点抑制，改变了许多癌症的治疗方案,并证实有一定的临床效果。

然而,免疫检查点疗法对许多患者并不奏效，甚至那些对治疗敏感的患者会经历复发，为此激发了人们寻找新方法或新工具来提高传统免疫疗法。

目前发现的针对CAFs分泌物靶点，如IL-6、VEGF等的治疗药物许多已进入临床试验。

CAFs通过分泌高水平的IL-6,重塑了TME中的免疫抑制TIL群体。

阻断IL-6信号可以改善T细胞的转运、迁移和肿瘤免疫抑制，从而改善包括食管癌在内的多种不同类型癌症患者的预后［69］O一些VEGF抑制剂正在进行临床试验，它们负责消耗内皮细胞,而内皮细胞是CAFs 的来源之一，通过减少CAFs的数量达到治疗效果［70,71］。

这些分泌因子虽然处于不同的信号网络,介导着不同的信号通路，但针对它们进行靶向治疗均能发挥作用。

联合治疗作为一种新兴的治疗方法，其涉及两种或两种以上的治疗方法。

联合治疗的基本原理是，不同的药物联合使用可以增加肿瘤的免疫原性,增强免疫治疗的效果［72］。

当肿瘤患者使用单一疗法时，往往效果甚微，然而在联合治疗中显示出良好的效果(如靶向分泌因子)，体现了联合疗法具有治疗癌症的巨大潜力［73］o如果结合不同种类的免疫制剂或其他药物，就能克服这种反应不足，从而增加治疗的成功概率并推迟获得性耐药。

3.1分泌因子通过调控PD-L1靶点治疗肿瘤CAFs来源的细胞因子可能促进PD-L1的表达。

之前的研究报道，CXCL5、MMP-9、IFN-酌、IL-6影响了PD-L1在癌细胞中的表达［74-77］。

CAF在肿瘤环境中分泌CXCL5，进一步结合癌细胞表面的CXCR2，激活PI3K/AKT通路,促进小鼠黑色素瘤和CRC细胞中PD-L1的表达，抑制抗肿瘤免疫［78］o癌细胞和间质细胞之间的相互作用对于肿瘤的发展至关重要。

因此,CXCL5在肿瘤微环境中的特性强烈支持其作为新的治疗靶点的可能性。

然而，它的应用需要进一步广泛的研究。

CXCL5-CXCR2轴可能成为黑色素瘤和CRC患者的治疗靶点。

通过阻断CXCL5-CXCR2可降低PD-L1的体外表达，是一种很有前景的治疗方法。

另外,CAF分泌的MMP-9通过降低肿瘤表面PD-L1的表达来负调控PD-1检查点抑制剂反应。

这种作用表明，MMP-9的药理抑制剂可以很好地与PD-1检查点抑制剂治疗相结合。

目前正在进行的一项临床试验正在研究一种MMP-9拮抗剂(andecaliximab，GS-5745)与一种PD-1抑制剂(nivolumab)在胃食管交界处腺癌联合应用。

这一策略似乎特别有希望用于治疗基质丰富的癌症，如胰腺癌［79］。

3.2分泌因子通过降低免疫抑制活性治疗肿瘤
肾素血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)的主要成分在肿瘤和间质细胞中表达,如巨噬细胞和CAF,被多次报道参与细胞的迁移、增殖、炎症及血管生成［80,81］。

在各类癌症模型中，RAS拮抗剂可以抑制肿瘤的进展，长期使用RAS抑制剂(如ACE抑制剂、ARB)可以预防癌症［82］。

血管紧张素域受体阻滞剂(angiotensin域receptor blockers, ARB)作为目前最常用的高血压一线治疗药物之一，不仅可以安全使用，且没有严重的副作用，还能改变多种肿瘤间质细胞的免疫抑制特性。

ARB降低CAF中趋化因子配体12等免疫抑制因子的表达，改变了MDSC和CAF的免疫抑制特性。

ARB和免疫治疗联合使用，可显著增强CD8+T细胞依赖性的抗肿瘤作用,降低MDSC细胞产生VEGF的能力。

显然，免疫疗法+“老药新用”，将来可能会是一个全新的治疗策略。

4总结与展望
优点：两个或以上的细胞表面分子可以定义一个特定的CAF亚群，维持癌症的干细胞特性，促进肿瘤的形成和化疗耐药。

靶向CAF亚群能精准地抑制肿瘤生长，降低化学敏感性。

理论上直接靶向肿瘤细胞的治疗方法存在许多不足，如肿瘤之间和肿瘤组织内部肿瘤细胞之间的异质性，是造成疗效差异的主要原因；肿瘤细胞生物学或遗传特点的不稳定性,在疾病进展和治疗过程中极难控制;在治疗过程中伴有耐药的肿瘤细胞克隆会出现。

而靶向于肿瘤微环境的治疗策略有其自身优势，如肿瘤间质
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细胞具有稳定的遗传背景,不易出现突变和耐药发生；肿瘤微环境的异质性更小,疗效相对稳定,并有可能预测肿瘤组织对治疗的反应性;在控制肿瘤转移方面可以发挥极为重要的作用。

局限性:基于肿瘤类型和位置,CAF某些特定的亚群具有促进或抑制肿瘤的趋势。

但影响这些表型的机制尚未阐明。

未来要将CAF应用到癌症治疗,必须首先解决CAF复杂性，使促肿瘤发生亚型可以被抑制或回复到静止状态。

虽然有报道称细胞内细胞因子表达可表征CAF亚群,但由于特异性细胞表面标记物的缺乏,极大地阻碍了CAF亚群分选和研究其功能异质性。

因此，确定CAF亚群，并针对这些亚群制定精确的抗免疫治疗策略是至关重要的。

展望:近年来，随着人们对CAF不断深入的了解，其在肿瘤的发生、转移及其在免疫抑制中发挥的作用是显而易见的，不过目前还找不到其特异性生物标记物。

CAFs可以分泌多种生长因子、细胞因子和趋化因子以及降解ECM的蛋白，靶向肿瘤部位，从而对肿瘤微环境的形成和肿瘤的进展起着重要的调节作用。

考虑到免疫激活的复杂性，需要采用联合疗法，而且由于肿瘤生物学特性在不同患者和肿瘤类型之间具有相当大的差异性，需要进一步探索患者特异性的生物标志物。

综上所述，联合治疗已显示出良好的治疗前景，但仍需要进一步和持续的研究来确定安全性、有效性、最佳组合、剂量和时机。

目前,IL-6阻滞剂已获得FDA的批准，这种重塑肿瘤微环境免疫抑制的方法未来将可能是临床上可行的策略，显示出巨大的临床治疗优势。

诸多研究揭示了靶向分泌因子在肿瘤免疫治疗中的重要作用。

其理论基础建立于重塑肿瘤炎症微环境,通过定位肿瘤细胞表面受体的分布，帮助免疫细胞对肿瘤细胞进一步的识别以及增强免疫细胞杀伤的特异性,这将为推动精准医疗做出进一步贡献。

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