玻片制备程序

2. 玻片制备程序：
(1)标本采集。

用肝素润湿的针筒采骨髓/外周血2-4ml，培养按步骤(2)操作，不培养按步骤
(3)操作。

（进行FISH实验一般采用肝素抗凝）
(2)培养法：混匀后注入两瓶含5ml培养液的标本瓶中，每瓶0.3～0.5ml；每瓶中加入PHA 0.2ml，孵箱中培养24-72小时，每日早晚各摇匀一次；阻断中期分裂相，与终止培养前2-4小时加入秋水仙素，终浓度为0.1μg/ml。

(3)不培养：提取有核细胞（淋巴细胞分离液或去除红细胞，或按照常规方法）
（如实验不需要染色体分裂相，可选用不培养法，步骤较简单；如果实验需要在染色体分裂相上进行，可选用培养法）
(4)收获细胞。

PBS洗，1200rpm，离心10分钟。

重复步骤（4）。

（在离心后,吸去上清液时,请注意上清中是否有油滴存在,如有, 应尽量吸去油滴）
(5)低渗。

吸去上清液，加入6～8ml预热至37℃的0.075mol/l KCl溶液，吹打悬浮细胞，37℃水浴温育20分钟，期间吹打2－3次。

（低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，例如水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、氯化钾等。

低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。

低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展。

该步骤的目的是使细胞尽量膨胀，理想状态是胞膜胀破得到裸露的细胞核）
(6)预固定。

直接于细胞低渗混合液中缓慢加入2ml固定液，混匀。

(7) 1200rpm，离心10分钟。

(8)固定。

去上清，加入6～8ml固定液，混匀。

静置10分钟
(9) 1200rpm，离心10分钟。

(10)重复步骤(8)和(9)。

（细胞在低渗处理后处于较脆弱的状态，固定的目的是让细胞保持在这一状态）
(11)细胞悬液的制备和保存。

去上清，根据细胞量加适量固定液，制成浓度合适的细胞悬液。

混匀后滴片。

此细胞悬液置-20℃冰箱中可保存1个月。

在此期间可随时取出，离心去上清加入新鲜固定液，制片供FISH检测之用。

（新鲜的标本容易得到好的杂交信号，建议使用新鲜标本。

）
（12）制片。

用吸管将细胞悬液轻轻吹打混匀后吸取少量，滴至干净的载玻片上，自然晾干。

剩余标本置于-20℃冰箱备用。

（根据明场显微镜下观察确定合适的细胞密度）
（13）老化玻片。

室温放置过夜或56℃烤片至少30分钟。

玻片放入片盒中，室温干燥保存。

建议不要将制好的片子放置太久，否则会影响信号的质量。

通常情况下，片子老化后马上进行检测。

（玻片老化时间或温度不足会导致实验操作中出现严重细胞脱落现象）
人的外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备
2011-09-09 20:52:10 来源：评论：0我要评论
人的外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备【实验目的】掌握人体外周血离体培养制备染色体标本的方法。

【实验原理】人外周血中的小淋巴细胞几乎都在G1期或G0期，一般情况下是不分裂的。

当在离体培养条件下加入植物凝血素（PHA），小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，随后进入…
人的外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备
【实验目的】
掌握人体外周血离体培养制备染色体标本的方法。

【实验原理】
人外周血中的小淋巴细胞几乎都在G1期或G0期，一般情况下是不分裂的。

当在离体培养条件下加入植物凝血素（PHA），小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。

经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。

【实验材料和用品】
1、材料：人外周血淋巴细胞
2、用具：注射器、离心管、吸管、试管架、量筒、培养瓶、酒精灯、烧杯、载波片、切片合、天平离心机、恒温培养箱、显微镜。

? 使用的玻璃器皿在洗液中浸泡过夜，再用流水冲洗过夜，捞起沥干，过三次蒸馏水后凉干，干热间歇消毒或高压消毒。

直接与培养细胞接触的器皿，最后一过宜用双蒸水。

橡胶制品不能用洗液浸泡，应用1%钠溶液煮沸半小时以上，流水冲洗后，高压消毒。

3、试剂药品
① RPMI1640培养基，含有20种氨基酸，维生素，生物素，碳水化合物，无机
②凝血素（PHA）激活细胞分裂
③青霉素、链霉素为广谱抗生素
④小牛血清，促进细胞繁殖和维持PH值
⑤肝素，主要起抗凝血作用
⑥秋水仙索，使细胞分裂停止在分裂中期
⑦固定液，使血清蛋白、核蛋白凝固
⑧姬姆萨染液，使染色体染色。

【实验步骤】
1、培养基的配制
2、采血培养
3、秋水仙素处理
4、收采淋巴细胞及制片
【制片步骤】
吹打成悬浮转入离心管加少量生理盐水洗瓶顷入离心管→离心1000 转/ 分8min →去上清液，加入温育蒸馏水6ml 吹打成悬液，置37 ℃中低渗25min →加入固定液1ml →离心，1000 转/ 分8min →去上清液，加固定液6ml, 吹打，静置15min →离心，1000 转/ 分8min →去上清夜，加固定液6ml 吹打, 静置15min →离心，1000 转/ 分8min →去上清夜，加固定液0.5ml 吹打至细胞成悬液→高空滴入冰玻片上, 边滴边吹→用酒精灯烤干，贴标签，放于玻片盒里凉干待用用3瓶的一管做G带滴8片，2瓶的一管做SCE滴5片. 标签分别为：。