免疫荧光方法

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免疫荧光（Immunofluorescence, IF）实验方法
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。

它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。

利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。

免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。

细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。

这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。

固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。

免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或 Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。

最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。

由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。

总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。

基本实验步骤：
（1）细胞准备。

对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

（2）固定。

根据需要选择适当的固定剂固定细胞。

固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。

PBS洗涤3×5 min.
（3）通透。

使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。

选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。

通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min.
（4）封闭。

使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min.
（5）一抗结合。

室温孵育1h或者4℃过夜。

PBST漂洗3次，每次冲洗
5min.
（6）二抗结合。

间接免疫荧光需要使用二抗。

室温避光孵育漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。

（7）封片及检测。

滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。

（一）细胞准备
用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。

贴壁良好的细胞一般在培养时直接放入coverslips让细胞生长在其上即可，尽量避免使用贴壁性能不好的细胞进行免疫荧光实验，以免后续的漂洗操作引起细胞脱落。

少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察，建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。

（二）固定和通透
除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。

固定的目的有三：
①防止细胞从玻片上脱落；
②除去防碍抗原-抗体结合的类脂；
③使标本易于保存。

标本的固定原则是：
①不能损伤细胞内的抗原；
②不能凝集蛋白质；
③应保持细胞和亚细胞结构；
④固定后应保持通透性，以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。

常用的固定剂有多种，应根据所研究抗原的性质和所使用的抗体特性选择适当的固定剂。

通常固定方法可以分为两类：有机溶剂和交联剂。

有机溶剂如甲醇和丙酮等可去除类脂并使细胞脱水，同时将细胞结构蛋白沉淀。

交联剂如多聚甲醛通常通过自由氨基酸基团形成分子间桥连，从而产生一种抗原相互连接的网络结构。

交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构，但因为交联阻碍抗体结合，可能会降低一些细胞组分的抗原性，因此需要增加一个通透步骤以使抗体能够进入标本。

两种固定方法都可能使蛋白抗原变性，因此使用变性蛋白作为抗原生产的抗体在免疫荧光中可能更为有效。

最常用的固定剂有多聚甲醛和甲醇，少数情况也使用乙醇，丙酮及戊二醛等进行固定。

通常，细胞结构抗原、病毒及一些酶类抗原使用丙酮、乙醇及高浓度的甲醛固定可获得较好的结果，而细胞膜相关组分抗原一般以多聚甲醛固定。

细胞器和细胞颗粒内的抗原一般也用多聚甲醛固定，并需要进行通透以使抗体能达到抗原表位。

通透步骤只在检测细胞内抗原表位的时候才需要，因为抗体需要进入细胞内部去检测蛋白。

但是，如果待检测的是跨膜蛋白，且其抗原表位处于胞质内区域，则同样需要对细胞进行通透。

相反，如果所检测的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，则不需要进行通透。

丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作为固定剂时是不需要通透的。

甲醇同样具有通透作用，但有些场合并不适合用甲醇，因为一些表位对甲醇非常敏感。

常用的通透剂是去垢剂，如Triton ,NP-40,以及Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm等。

Triton和NP-40属于烈性去垢剂，可部分溶解细胞核膜，因此非常适合核抗原检测。

但应该注意的是，如果在高浓度下使用或者作用时间过长，它们将破坏蛋白，从而影响实验结果。

Triton X-100是最常用的通透剂，但是它将破坏细胞膜，因此不适用于细胞膜相关抗原。

后面一组去垢剂要温和得多，它们可以在细胞质膜上形成足够大的孔隙以允许抗体通过，但是不会溶解细胞质膜。

适于胞质抗原或者质膜上靠近胞质一面的抗原，也适于可溶性的核抗原。

一般的操作程序是先固定后通透，但针对有些水不溶性的目的抗原的检测宜先通透再固定，这样做的原因主要是可以通过通透去除许多水溶性的蛋白，从而大大减少了免疫荧光的背景和非特异性信号。

固定后以冷PBS液漂洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。

（三）封闭
封闭的目的是为了减少抗体的非特异性结合，最常用的封闭剂为1% BSA, PBS pH ,其他可选择的封闭剂还有 1% gelatin, 1%bovine 或与二抗种属相同的血清（3-10%）等。

（四）抗体孵育
直接免疫荧光法中的一抗和间接免疫荧光法中的二抗都是荧光抗体，因此在这些抗体孵育的时候必须注意避光。

此外，为保证结合质量和防止干燥，抗体孵育应尽量在湿盒中进行。

（五）封片及荧光观察
标记好荧光的细胞片原则上可以直接进行观察，特别是有时候封片不当反而使得前功尽弃。

但在绝大多数情况下，为了保存结果，以便进一步观察、照像、统计分析等，需作封片处理。

常规的方法是采用甘油或中性树脂封片，为了增强封片的效果，往往需要在封片时添加特殊的抗荧光淬灭剂。

（六）标本保存
由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。

因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。

由于性能良好的抗荧光淬灭剂的出现，荧光标记的标本可以在低温（4℃或-20℃）下保存相当长的时间。

在某些情形下，考虑到实验的成本及实验条件，也可以采取权宜的办法，比如固定标本片后低温保存，在需要时再进行荧光标记，即随用随染。

直接免疫荧光法测抗原
基本原理
将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。

其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少。

缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。

此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。

试剂与仪器
磷酸盐缓冲盐水（PBS）：L，
荧光标记的抗体溶液：以L，的PBS进行稀释
缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+ 碳酸盐缓冲液1份配制
搪瓷桶三只（内有L，的PBS 1500ml）
有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）
荧光显微镜
玻片架
滤纸H
37℃温箱等。

实验步骤
1、滴加L，的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。

2、滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。

3、取出玻片，置玻片架上，先用L，的PBS冲洗后，再按顺序过L，的PBS三缸浸泡，每缸 3-5 min，不时振荡。

4、取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。

5、立即用荧光显微镜观察。

观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：
（-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；
（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。

待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±）或（-），即可判定为阳性。

注意事项
1、对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释度不应超过1：20，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察。

2、染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min到数小时，一般30 min已足够。

染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果，但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。

低温染色过夜较37℃30 min效果好的多。

3、为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染色的干扰。

（1）标本自发荧光对照：标本加1-2滴L，的PBS。

（2）特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗体。

（3）阳性对照：已知的阳性标本加荧光标记的特异性抗体。

如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，阳性对照和待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。

4、一般标本在高压汞灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。

免疫荧光染色（间接法）
1、切片固定后用毛细滴管吸取经适当稀释的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的湿度，37℃作用30min。

然后用l 洗两次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液体。

2、再滴加间接荧光抗体（如兔抗人 -球蛋白荧光抗体等），同上步骤，染色30min，37℃，缓冲盐水洗两次10min，搅拌，缓冲甘油封固，镜检。

对照染色：①抗体对照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法进行染色，结果应为阴性。

②抗原对照：即类属抗原染色，亦应为阴性。

③阳性对照。

间接法中上述方法称双层法（Double Layer Method）。

另一种称夹心法，即用未标记的特异性抗原加在切片上先与组织中之相应抗体结合，再用该抗原之荧光抗体重叠结合其上，而间接地显示出组织和细胞中抗体的存在，方法步骤如下：
①切片或涂片固定后，置于染色湿盒内。

②滴加未标记的特异性抗原作用切片于37℃，30min。

③缓冲盐水洗2次，每次5min，吹干。

④滴加特异性荧光抗体再用切片于37℃，30min。

⑤如③水洗。

⑥缓冲甘油封固，镜检。

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细胞内抗原的检测-间接免疫荧光法
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细胞内抗原的检测过程与细胞表面抗原检测过程基本一致，只是在与一抗孵育前，需要预先对细胞用非离子去污剂进行透化处理。

【操作方法】
（1）取已固定好的细胞爬片或甩片或经过预处理的组织切片（石蜡或冰冻切片）；
（2）用含%TritonX-100或NP-40的PBS溶液透化固定后的细胞2min（室温），有些标本可能需要长达15min，时间视抗原而定；
（3）余下步骤接上述“细胞表面抗原的检测-间接免疫荧光法”步骤（2）；
【注意事项】
（1）在使用前，一抗二抗均应测试其合适的稀释度。

（2）多聚甲醛的固定是不稳定的，标本经多聚甲醛固定后，应再用去污剂处理，如果标本在水溶液中浸泡的时间过长，则会使交联结构解体。

因此，应避免固定后的标本在水溶液中浸泡的时间过长。

（3）信号微弱的解决方法：
①提高一抗和二抗的浓度以增强敏感性，这必须测试各种浓度抗体的滴度；
②延长一抗和二抗的孵育时间。

由于细胞染色时抗原吸附在固相载体上，抗原抗体结合时间较在溶液中长。

孵育时间可因实验设计作适当调整，但少于20min抗体和抗原几乎不能有效结合。

在以上两点中，应摸索出一个最佳条件以产生有效信号且保持良好的背景。

这就需要反复试验，因为每组抗体和抗原的情况会有所不同；
③改变检测方法，用共聚焦显微镜观察，可提高敏感性。

（4）背景不好的解决方法
细胞样本进行荧光染色时，背景问题主要来自两个方面，即非特异性染色和特异性交叉反应。

①非特异性吸附：非特异性吸附背景问题的产生与抗原抗体的特异性结合无关。

即一抗或二抗与样品相互作用而发生吸附，而不是与抗原发生特异性结合。

*将所有抗体溶液或含蛋白的检测试剂用100，000′g离心30min以去除蛋白聚合物。

*滴定一抗和所用的检测试剂，以确定能够产生合适信号的最低浓度。

*固定后，用饱和量并不被检测试剂结合的非特异性抗体封闭样品，有效的封闭液包括5%的与标记二抗来源相同的同种血清、3%的BSA和3%的脱脂奶粉。

*用上述封闭液稀释抗体和检测试剂。

*固定后，在所有的缓冲液及洗涤液中加入2%吐温-20。

*缩短一抗或标记试剂的孵育时间。

*充分洗涤（延长洗涤时间，重复次数）。

*改变检测方法。

②特异性背景：造成特异性背景问题的原因有三种因素，即污染抗体所致假阳性、交叉反应和样品中含有能与Ig结合的蛋白质。

*如用多克隆抗体，应滴定抗体（假阳性）。

*如用多克隆抗体，亲和纯化特异性抗体（假阳性）。

*如用多克隆抗体，用适当的丙酮肝脏粉吸收以阻抑假阳性。

*换用其他抗体（交叉反应及假阳性）。

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