抗菌蛋白培养基优化测定性质分离纯化等方法

2.2拮抗菌株及其抗菌蛋白抑菌活性测定方法
2.2.1平板对峙法
在PDA平板上将病原菌接菌丝块（ф＝8mm）和拮抗菌接距中心2cm的同一直线上，培养一定的天数后观察抑菌状况（梁建根等，2006）。

2.2.2生长速率法
将待测的抗菌蛋白用定量的灭菌蒸馏水稀释成一系列浓度梯度，取1mL稀释液放入直径9cm的培养皿内，与9mL融化好的PDA培养基混合均匀制成平板，接入培养好的直径8mm真菌菌丝块，置于22℃的条件下恒温培养72h后，测定菌落直径，以不加药的对照菌落相比较，计算药剂的抑菌率。

2.2.3平板打孔法
在PDA平板上将供试真菌菌饼（ф＝8mm）接种于平板中央，28℃培养箱中培养24h后，在新长成的菌丝周围打孔（ф＝8mm），将待测的抗菌蛋白注入孔内，每孔约60μl，22℃下再培养，观察抑菌状况和抑菌圈大小。

2.2.4蛋白含量测定方法
2.2.4.1试剂
（1）标准牛血清蛋白质溶液：称取牛血清蛋白25mg，加水至100mL，吸取40mL，加去离子水定容至100mL。

（2）考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝G-250，溶于
50mL95%的乙醇后，再加入120mL 85%的磷酸，用去离子水稀释至1L。

2.2.4.2方法
取6支具塞试管，按上表加入试剂，混合均匀后，向各管加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，摇匀，并放置5min，用1cm光径比色杯在595nm21比色吸光度，空白对照为第1号试管。

以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

（2）样品蛋白质含量测定
另取一支试管，加入0.2mL样品提取液，加入0.8mL去离子水和5mL考马斯亮蓝G-250，充分混合，放置5min，用1cm光径比色杯在595nm比色吸光度。

2.3拮抗菌株及其抗菌蛋白的活性测定
2.3.1拮抗菌株及其抗菌蛋白的抑菌谱
采用平板对峙法和平板打孔法分别测定短小芽孢杆菌BSH-4及其抗菌蛋白（LB培养基发酵两天后硫酸铵沉淀提取）的抑菌活性及其抑菌谱。

供试真菌为黄瓜菌核病菌S.sclerotiorum、黄瓜猝倒病菌Pythium spp.、黄瓜蔓枯病菌Mycosphaerella melonis、黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum、黄瓜立枯病菌Rhizoctonia solani、番茄早疫病菌Alternaria solani、辣椒疫病病菌Phytophthora capsici、茄子绵疫病菌Phytophthora parasitica。

2.3.2不同转接次数的拮抗菌株的抑菌活性
将短小芽孢杆菌BSH-4在LB固体培养基上划线，28℃培养，一周后按相同方法转接，共转接8次，用平板对峙法测定不同转接次数后拮抗菌株的抗菌活性。

2.4无菌发酵液的制备方法
用灭菌牙签挑取一个BSH-4单菌落到含10mL LB液体培养基的50mL三角瓶中，置37℃180r/min的振荡器中振荡培养过夜(24 h)。

按5％接种量接种到容量为250mL的发酵瓶中（装LB液体培养基100 mL)，置37℃180r/min的振荡器中振荡培养48h，10000r/min离心20min，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，即为无菌发酵液。

2.5抗菌蛋白的提取及最适硫酸铵饱和度的确定
将培养的无菌发酵液分别加固体硫酸铵至20％、40％、60％、80％和100％饱和度，置4℃下过夜。

然后用高速冷冻离心机在10000r/min,4℃下离心20min。

每50mL培养液所得沉淀用2 mL的20mmol/L的Tris-Hcl（pH7.5）缓冲液悬浮。

用平板打孔法测定沉淀蛋白悬浮液的抑菌活性，22比较采用不同饱和度的硫酸铵所沉淀蛋白的活性差异。

2.6短小芽孢杆菌BSH-4发酵条件的优化
2.6.1培养方法
种子培养：在100mL三角瓶中装入50mL种子培养基，接入斜面，活化菌种，于旋转摇床（180 r/min、37℃）恒温振荡培养24 h，作为发酵的种子液。

摇瓶发酵培养：在50mL三角瓶中装入30 mL基础培养基，接种量为5%，30℃恒温培养，初始pH值7.0，摇瓶转速150 r/min、培养周期48 h，以此为对照，分别进行碳源、氮源和无机盐单因素和正交试验，进行发酵条件研究。

2.6.2培养基的优化
2.6.2.1单因素试验
（a）碳源：分别用1%的可溶性淀粉、玉米淀粉、甘露醇和蔗糖等量替代基础培养基中的葡萄糖进行发酵培养，以不接入碳源的培养基为对照。

采用摇瓶发酵培养条件，48 h后测定发酵液的抑菌活性，以确定最佳碳源。

（b）氮源：分别用1%的酵母浸膏、牛肉膏、胰蛋白胨和大豆蛋白胨等量替代基础培养基中蛋白胨，以不接入氮源的培养基为对照。

采用摇瓶发酵培养条件，48 h后测定发酵液的抑菌活性，以确定最佳氮源。

（c）无机盐：分别用0.4%的硫酸镁、硫酸铁、氯化钾、氯化钙替代基础培养基中的Na2HPO4和NaH2PO4，以不加入无机盐的培养基为对照。

采用摇瓶发酵培养条件，48h后测定发酵液的抑菌活性，以确定最佳无机盐（权春善等，2006）。

2.6.2.2正交试验
将筛选出的最佳碳源、氮源和无机盐3个因素，选用3因素3水平的L9(33)正交表进行试验，以做进一步优化。

正交试验因素及其水平见表1。

23
表1正交试验因素水平表
2.6.3发酵条件的优化
采用最优培养基配方，固定摇瓶培养的其它发酵条件后，对最佳发酵时间、摇瓶转速、温度、初始pH值、接种量、装液量进行逐一优化。

2.6.4测定方法
菌体浓度的测定：采用紫外分光光度计，测定菌液的OD600值。

拮抗物质浓度的测定：采用考马斯亮蓝染色法，测定OD595值，以牛血清蛋白为标准蛋白。

抗菌蛋白抑菌活性的测定：采用平板打孔法测定。

2.7抗菌蛋白粗提液理化特性测定
2.7.1热稳定性
将经最适硫酸铵饱和度沉淀得到的抗菌蛋白粗提液分别经10、30、50、80和100℃处理60 min后，平板打孔法测定活性，观察抑菌圈变化。

以未进行温度处理的抗菌蛋白粗提液作对照（顾真荣等，2004）。

2.7.2 pH稳定性
将经最适硫酸铵饱和度沉淀得到的抗菌蛋白粗提液用乳酸和氢氧化钠分别调至pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12并于4℃过夜，然后将各pH值调回中性，进行生物活性测定。

以未进行pH处理的抗菌蛋白粗提液作对照（刘焕利等，1995）。

2.7.3紫外照射稳定性
将经最适硫酸铵饱和度沉淀得到的抗菌蛋白粗提液在20W紫外灯下分别照射1、3、5、8、10、12h（距离10cm），然后用平板打孔法测定其活性。

以未经紫外照射的抗菌蛋白粗提液为对照。

2.7.4对有机溶剂的稳定性
将经最适硫酸铵饱和度沉淀得到的抗菌蛋白粗提液分别加入等体积的乙醚、丙酮、氯仿和甲醇，充分混匀30min后，热水浴（50℃）去除有机溶剂后检测活性。

以不经有机溶剂处理的抗菌蛋白粗提液为对照。

2.7.5金属离子稳定性
将经最适硫酸铵饱和度沉淀得到的抗菌蛋白粗提液分别加入Na+、K+、
Mg2+、Cu2+、Ca2+、Ag+、Li+和Zn2+，使金属离子的终浓度为10mmol/L，混匀反应30min后用平板打孔法测定活性（Gao XA,et al，2008；Radhika T.,etal，2008）。

分别以未经金属离子处理的抗菌蛋白粗提液和仅由缓冲液与金属离子组成的混合液为对照。

2.7.6 对有机溶剂的敏感性:
在抗菌粗蛋白中分别加入等体积的乙醚、乙酸乙酯、石油醚、三氯甲烷、丙酮和甲醇 ,充分混匀 30min后 ,热水浴 (约50 ℃)去除有机溶剂后检测活性。

2.7.6蛋白酶稳定性
将经最适硫酸铵饱和度沉淀得到的抗菌蛋白粗提液分别加入蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶，使其终浓度均为1mg/mL。

37℃下反应2 h后，用平板打孔法测定活性(刘静等，2004；Xing-Ai Gao，et al，2008)。

以未经蛋白酶处理的抗菌蛋白粗提液为对照。

2.7.7抗菌蛋白粗提液的底物特异性
以几丁质、羧甲基纤维素和β-1,3-葡聚糖为底物进行抗菌蛋白底物特异性测定。

分别在胶体几丁质培养基平板、1%羧甲基纤维素培养基平板和茯苓粉培养基平板中心打孔，每孔注入约100μL抗菌蛋白粗提液及经100℃处理1h的抗菌蛋白
粗提液，每处理重复3次，观察底物分解情况，即透明圈的出现情况（许正宏等，2005）。

2.8短小芽孢杆菌BSH-4抗菌蛋白对核盘菌的抑菌机制研究
2.8.1对核盘菌菌丝生长的影响
采用菌丝生长速率法。

在预备试验的基础上，无菌条件下选择短小芽孢杆菌BSH-4抗菌粗蛋白对核盘菌菌菌丝生长抑制率在10％～90％范围内的5个系列浓度，制成含药培养基，将菌饼菌丝面朝下接种到含药平板中央（平板中加入硫酸链霉素抑制细菌的生长）,每处理设3次重复，置于(22±1)℃下培养72 h，用十字交叉法测量菌落直径，计算抑制率。

所得数据用DPS统计软件求出毒力回归方程及EC50值和EC90（陈召亮等，25 2007；潘金菊等，2006）。

2.8.2对核盘菌菌丝形态的影响
在上节试验的基础上，观察经不同抗菌粗蛋白浓度处理后的菌丝形态，并挑取经EC90浓度抗菌粗蛋白处理的菌丝，制成玻片，在显微镜下观察菌丝形态。

2.8.3对核盘菌菌核形成及单重的影响
在上节试验的基础上观察各浓度的抗菌粗蛋白对菌核形成的影响。

同时选择短小芽孢杆菌BSH-4抗菌粗蛋白的EC50和EC90浓度进行皿内抑制培养处理，至各培养皿菌丝不再快速生长、产生黑褐色菌核为止，记录菌核形成的时间、菌核数量，并称量菌核单重（潘金菊等，2006）。

2.8.4对核盘菌菌核萌发的影响
将黄瓜菌核病菌接种到PDA培养基上，25℃培养15d，待菌核开始变褐时收集大小一致的菌核，置于铺有灭菌滤纸的无菌培养皿中，滴加少量的灭菌水保湿培
养，至菌核完全变褐成熟，菌丝全部死亡。

在上述试验基础上，根据抗菌粗蛋白EC50浓度设计并配制系列浓度，
将表面无菌丝的成熟菌核置于含有系列浓度抗菌粗蛋白的PDA平板上。

25℃恒温培养，统计菌核萌发率，测出抑制萌发的最低浓度。

试验重复3次，每重复测定10个菌核（潘金菊等，2006）。

2.8.5对核盘菌菌丝体细胞膜渗透势的影响
将黄瓜菌核病菌置于PDA平板上，25℃下培养5d，在菌落边缘制取直径为
4mm的菌饼分别接入PD培养液中，120r/min振荡培养2d后取菌丝备用。

新鲜菌丝用重蒸水冲洗，真空抽滤后称取菌丝鲜重0.2g放入锥形瓶中，分别加入由25mL重蒸水稀释的系列浓度抗菌蛋白中。

25℃下恒温水浴中振荡（120r/min），分别测定在0、5、15、30、60、120、150min
时的电导率（石志琦等，2000）。

以不加入抗菌粗蛋白但含有相同浓度硫酸铵的Tris-HCl缓冲液为对照，对照药剂腐霉利以不加入腐霉利原药的其它助剂为对照。

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2.9抗菌蛋白的初步分离
2.9.1 Sephadex G-100凝胶层析
2.9.1.1 Sephadex G-100凝胶的预处理。