对虾WSSV病毒VP281基因的siRNA筛选研究

表达 ， 半定量 Ｒ －Ｃ ＴＰ Ｒ方法检验 ｓ Ｎ ｉ Ａ抑制 Ｖ２ １ 因转录 的效果。结果 显示，Ｅ Ｆ Ｖ２１可在 Ｂ Ｋ细胞正 常表达 融合 蛋 白 Ｒ Ｐ８ 基 ｐ Ｇ Ｐ－Ｐ８ Ｈ
Ｇ ＰＶ２１ 对 ｓ Ｎ Ｆ － ８ 。３ ｉ Ａ对 Ｇ Ｐ Ｖ ２ １的 ｍ Ｎ Ｐ Ｒ Ｆ －Ｐ ８ Ｒ Ａ转录均有 不同程度的干扰效果， Ｒ Ａ ｓ Ｎ ２的干扰 效果 最为显著 。构建 针对 ＷＳＶ ｉ Ｓ． Ｖ ２ １基 因的 ｓ Ｎ Ｐ８ ｉ Ａ筛选体 系， Ｒ 初步验证 了该 系统的有效性 ， 为开展 ｓ Ｎ ｉ Ａ抗 ＷＳＶ研究建 立 了 Ｒ Ｓ 基础。
Ｌ ｎ ‘ Ｃ Ｎ ａ ．ａ 。， ＨＥ Ｘｉ－ｉ ， Ｐ Ｎ ｉ－ｉ ， ｈ ｎｘａ ， ＩＭｉ ｇ ， ＨＥ Ｘｉｏｈ ｒ Ｃ Ｎ ｕ ｌ ｔ Ｅ Ｇ Ｊｎｘａ ＭＡ Ｃ ｕ －ｉ２
ＪＡＮＧ ＨＡＯ ｎ －ｈ ｎ ＹＡＮＧ ｕ －ｉｇ ， ＩＹｏ ｇｍｅ ‘ Ｙｏ ｇｚ ｅ ， Ｃｈ ｎ ｌ Ｌ ｎ — ｉ’ ｎ
ｔｒｅｉｇＶ ２ １ Ｖ ２ １ｓ Ｎ １ Ｖ ２ １ ｓ Ｎ ２ Ｖ ２ １ｓ Ｎ ３ ｅｅｄｓ ｅ ｙｇｆ Ｉ ．Ｅｃ ｉＮ ａ ｙ ｔｅｉ ｄｂ ｈ ｍｃ ａｇｔ Ｐ ８ （ Ｐ ８ －ｉ Ａ ，Ｐ ８ － ｉ Ａ ， Ｐ ８ － Ｒ Ａ ）ｗ ｒ ｅｉ ｄ ｂ ｏｗｉ ｎ Ｒ Ｒ ｉ ｎ ｇ ｔ ｌ ａｈｓ Ａ Ｗ ｓｎｈｓ ｅ ｙｃｅ ｉａ ￣ Ｒ ｓ ｚ ｌ
对 虾 ＷＳＶ病 毒 Ｖ ２ １基 因的 ｓ Ｎ Ｓ Ｐ８ ｉ Ａ筛 选研 究 Ｒ
黎 铭 陈晓汉 陈秀荔 彭金 霞 马春 霞 蒋伟 明 ， ， ， ， ， ， 彭 敏 赵 永 贞 杨春玲 李咏梅 ， ， ，
（． １广西水产研究所遗传育种 与健康养殖重点实验室 ， 广西 南宁 ５ ０ ２ ；． ３０ １２ 广西兽医研究所 ， 广西 南宁 ５ ００ ） ３ ０ １
ａ ｕ ｐ ｓｉｇｔｅＷ Ｓ Ｖ ｅ ｒｄ ｃ ｎｓ ｒｍｐ ８ｓｐ ｒ ｓｎ Ｓ ｒｐｏ ｕ ｅｉ ｈｉ ． ｅ ｈ
Ｋ ｅ ｒ ｓ： ｈｉ ｙ ｗｏ ｄ Ｓ ｒ ｍｐ； Ｓ ；Ｐ２ １； ＷＳ Ｖ Ｖ ８ ＲＮＡ ｎｅｆｒｎ ｅ ｉｔｒ ｅ ｃ ｅ
白斑综合症 （ ｉ ｏ ｓ ｄ ｍ ， Ｓ 是危害 Ｗｈ ｅ ｐｔｙ ｒ ｅＷＳ ） ｔｓ ｎ ｏ 世界对虾养殖业最严重 的病毒性疫病之一 ， 其病原 为 白 斑 杆 状 病 毒 （ ｉ ｐｔ ｓ ｄ ｍ ｖｕ ， ｈ ｅ Ｗ ｔ ｓｏ ｙ ｒ ｅ ｉ ｓ ｎ ｏ ｒ ＷＳ Ｖ 。Ｗ Ｓ Ｓ ） Ｓ Ｖ除可 以感染对虾之外 ， 还可以感染
５ 期
黎
铭等 ： 对虾 Ｗ Ｓ ＳＶ病毒 Ｖ２１基因的 ｓ Ｎ Ｐ８ ｉ Ａ筛选研究 Ｒ
１９ ９３
过程中起重要作用。 目前 已经确认 了 １ 个 ＷＳ Ｖ ８ Ｓ 病毒 结 构 蛋 白， 中 Ｖ ２ 、 Ｐ２ Ｖ １ 、 Ｐ６ 、 其 Ｐ ８ Ｖ ２ 、 Ｐ ９ Ｖ ４ ６ Ｖ ２１ Ｐ ８ 与囊膜有关 ， Ｐ６和 Ｖ ２ Ｖ２ Ｐ ４与核衣壳构成有 关 。Ｖ ２ １ Ｐ ８ 含有 一个 Ｒ Ｄ基序 ， Ｇ 为细胞 粘附域， 在 介导细胞识别 、 病毒感染 中起重要作用 】 。
Ｒ Ａ干 扰 （ Ｎ ｎｅ ｅ ｎｅ Ｒ Ａｉ是 一 种 转 Ｎ Ｒ Ａ ｉｔｆｒ ｃ ， Ｎ ） ｒ ｅ
增 片段 Ｖ ２ １与 ｐ Ｇ ＰＣ Ｐ８ Ｅ Ｆ —１载体 分 别 进 行 Ｒ和 Ｉ Ｓｌ ａ Ｉ双 酶 切 。 回 收 酶 切 后 的 Ｖ ２ １（ １ ｐ 和 Ｐ ８ ６５ ｂ ）
摘
要： 构建一个 对虾 ＷＳＶ Ｖ ２１基 因的 ｓ Ｎ Ｓ Ｐ ８ ｉ Ａ筛选体 系， Ｒ 获取有效 ｓ Ｎ ， ｉ Ａ 为进一步开展 ｓ Ｎ Ｒ ｉ Ａ抗 ＷＳＶ研究建立基 础。根据 Ｒ Ｓ
已报道的 Ｖ ２ １ 因编码序列 ， Ｐ８ 基 设计并合成 一对引物 ， 扩增出带双酶切位点 的 Ｖ ２ １ Ｐ ８ 。对 Ｖ ２ １和质粒 ｐ Ｇ ＰＣ 分别酶切后进 Ｐ８ Ｅ Ｆ －１ 行连接 ， 获取表达载体 ｐ Ｇ ＰＶ ２ １ Ｅ Ｆ －Ｐ ８ 。利用专 业软件设计 ３对靶 向 Ｖ ２１的 ｓ Ｎ （ Ｐ ８ ・ Ｒ Ａ Ｐ８ ｉ Ａ Ｖ ２ １ｓ Ｎ １、 Ｖ ２ １ｓ Ｎ ２、 Ｖ ２ １ Ｂ ｉ Ｐ８一Ｒ Ａ ｉ Ｐ ８－ ｓＮ３， ｉ Ａ ） 并合成 ｓ Ｎ ， ３ ｓ Ｎ Ｒ ｉ Ａ 将 种 ｉ Ａ分别 与ｐ Ｇ Ｐ Ｖ ２ １ Ｒ Ｒ Ｅ Ｆ －Ｐ ８ 共转染 Ｐ Ｋ细胞。采用 Ｗ ｓ ｒ ｂ ｔ ｅｔ ｌ 方法检测 Ｇ ＰＶｒ １ ｅ ｏ ｎ Ｆ －ｔ ８ 融合 蛋 白的 ２
以 ＷＳＶ在水产病害防控技术研究领域一直备受关 Ｓ 注 【 。尽管 ＷＳＶ危害严重 ， ３ Ｊ Ｓ 但至今还没有一种有 效 的防控方法。 ＷＳＶ属 双链 Ｄ Ａ病 毒 ， 基 因组 大 小 约 ３０ Ｓ Ｎ 其 ０ ｋ ， １０个开 放阅读框 架 ， ｂ含 ８ 编码 ５ ０种氨基 酸 多 肽［ ５ ４］ － 。ＷＳＶ囊膜蛋白可以识别并结合宿主细胞 Ｓ
ｐ Ｇ ＰＣ （ ７０ｂ ） 用 Ｔ Ｄ Ａ连接 酶将两者 连 Ｅ Ｆ —１ ４ ０ ｐ ， ４ Ｎ 接。在新建的 ｐ Ｇ ＰＶ ２ １中 Ｖ ２ １在 Ｇ Ｐ下游 Ｅ Ｆ —Ｐ ８ Ｐ８ Ｆ
并 与之 直接 相 连 ， 成 Ｇ ＰＶ ２ １融 合 表 达 序 列 。 构 Ｆ －Ｐ ８ 表达 载体 ｐ Ｇ ＰＶ２ １构 建 后 进 行 酶 切 和 测 序 鉴 Ｅ Ｆ ．Ｐ ８ 定（ 上海 生工生 物有 限公 司 ） 。
关键词 ： 对虾 ； Ｓ Ｖ ２ １ Ｒ Ａ干扰 ＷＳ Ｖ；Ｐ ８ ； Ｎ
中图分类号 ： ４ ． ６ ￥ ５４ ９
文献标识码 ： Ａ
ｓＲＮＡ ｎ ｅ ｆ ｒ ｎ ｅ ｏ Ｐ ８ ｎ ｆＳ ｒｍｐ Ｗ Ｓ Ｖ ｉ Ｉ ｔ ｒ ｅ ｅ ｃ ｎ Ｖ ２ １ Ｇｅ ｅ ｏ ｈ ｉ Ｓ
ｄ ｖｌｐ ｄ ｗｈｃ ｕｄｐ ｏｉｅａｐａ ｏｍ ｆｒｃ ｏ ｓｎ ｐ ｉｃｓＲＮＡｓｆｒＶ ８ ｎ ｓ ｒｖｄ ｏ ｎ ａ ｏ ｏｒｔｅｆｒｈ ｒｒｓａｃ ｕ ｈ ｅ ｅｏ ｅ ｉ ｈｗｏ ｌ ｒｖｄ ｌｔ ｒ ｏ ｈ ｏ ｉｇｓｅ ｆ ｉ ｆ ｃ ｉ ｏ Ｐ２ １ａ ｄ ａ ｏｐ ｉ ｅａｆｕ ｄ ｔ ｎｆ ｈ ｕ ｔｅ ｅｅｒ ｈｓ ｃ ｌ ｏ ｉ
西
南
农
业
学
报
２１ ０ １年 ２ ４卷 ５期
Ｖ０． ４ １２ Ｎｏ ５ ．
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文章 编号 ：０ １４ ２ （０ １０ － ９ －５ １０ －８９ ２ １ ） ５１ ２０ ９
（ ． ｅ ａ ｍｔ ｙｏ ｑ ａｉ Ｇ ｎ ｔ ｒ ｄｎ ｎ ｅｌ ｙＡ ａｕｔｒ， ａ ｇｉ ｎｔｕｅｏ ｉ ｅ ｅ， ｕｎ ｘ Ｎ ｎ ｉｇ５ ０ ２ ， ｈｎ ； １ Ｋ ｙＬ ｂ ｏ ｆ ｕ ｔ ｅｅｉ Ｂ ｅ ｉｇａｄＨ ａｔ ｑ ｃｌ ｅＧｕｎ ｘ Ｉｓｔｔ ｆＦｓ ｒ ｓＧ ａｇｉ ａ ｎｎ ３ ０ １ Ｃ ｉａ ｅ ｒ Ａ ｃ ｃ ｅ ｈ ｕ ｕ ｉ ｈｉ
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（ ０ ７ Ａ ２ Ｂ １ ，０８ Ａ Ｂ Ｂ ３ 。 ２０ Ｂ Ｄ ９ ０ － ２０ Ｂ Ｄ ９ ０ ） ６ 作者简介 ： 铭 （ ９０一）， ， 黎 １８ 男 广西北 流人， 助理研究员 ， 主要 从事海洋经济动物病害研究工作 ， 为通讯作者 。 ・
表面受体 ， 介导病毒入侵宿主细胞 ， 因此在对虾感染
２ Ｇ ａｇｉ ｅ ｒ ａｙＲ ｓａｃ ｓｔｔ。 ｕｎ ｘ Ｎ ｎ ｉｇ５００ ，ｈｎ ） ． ｕｎｘ Ｖ ｔ ｉ ｒ ｅｅｒｈＩ ｔｕｅ Ｇ ａｇｉ ａｎｎ ３ ０ １ Ｃ ｉａ ｅｎ ｎｉ
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收稿 日期 ：００— ７—２ ２１ ０ ６ 基 金项 目： 广西科学研究与技术开发项 目（ 桂科基 ０ ３０ ５ ； ７ １３ ） 广 西科 学基金 项 目（ 桂科 青 ０ ３０ ９ ； ８２ ６ ） 国家科 技支 撑计 划 项 目
蟹 类 、淡 水螯 虾等 甲壳 动 物 ¨ ２。ＷＳＶ 可在 ２～ －］ Ｓ １ ０ｄ内给对 虾养 殖场 造成 １０％ 的 累计死 亡 率 ， ０ 所