三角褐指藻ptcryp基因的克隆及敲除载体构建

蜃
赵靖悦，龚林，雷娜娜，陈由强，何文锦：三角褐指藻RQyP 基因的克隆及敲除载体构建
三角褐指藻R5P 基因的克隆及敲除载体构建*
*基金项目：国家糖料产业技术体系（项目编号：CARS-170501 ）
收稿日期：2019-09-17
作者简介：赵靖悦（ 1993—）,福建厦门人，女，硕士研究生，主要研究方向：生物化学与分子生物学。

通讯作者：何文锦（ 1972—），女，福建福州人，副教授，主要研究方向：植物分子生物学研究，
E -mail ： biohwj@fjnu .edu .cn o
赵靖悦，龚林，雷娜娜，陈由强，何文锦
（福建师范大学生命科学学院海洋生物医药与制品产业化开发技术公共服务平台；福建师范大学南方海洋研究院福建省微藻种质改良工程技术研究中心，福建福州350117）
摘要：文章旨在获得三角褐指藻中隐花色素切7的全长序列并进行生物信息分析，且利用CRISPR /Cas9系统的pKS
diaCas -sgRNA 质粒，通过质粒酶切、引物退火、连接重组质粒，成功构建了三角褐指的敲除载体，并通
过DNA 测序确定插入了sgRNA 序列。

PQtyP 基因的开放阅读框全长为1575 bp,编码524个氨基酸，预测的等电点
8.30，理论分子量58.98 kD 。

通过结构域分析，隐花色素蛋白的典型结构域存在于PtCryP 蛋白中。

本研究首次构建
了三角褐指藻PtCryP 的CRISPR /Cas9敲除载体，为下一步三角褐指藻CryP 的表达和功能研究奠定基础。

关键词：三角褐指藻；3°基因；生物信息学分析；CRISPR /Cas9
doi : 10.3969/j.issn .1007-550X .2019.12.001
中图分类号：S 154.38+4
文献标识码：A 文章编号：1007-550X （2019）12-0008-09
光对于绝大多数生物体来说都是一个很重要的 环境因素。

一方面，光能驱动植物和藻类的光合作
用，另一方面生物体的光形态建成过程中，通过光
受体感知光，诱发下游信号转导级联反应。

隐花色
素（Cryptochrome ）是目前已经明确的蓝光受体之
一叫
隐花色素是第一个在拟南芥（Arabidopsis
thaliana ）中被鉴别出的黄素蛋白蓝光受体，在生长
和发育中起着重要作用
［2
-4］。

隐花色素/光裂解酶家
族一般具有2个功能区，即氨基端高度保守的光裂解 酶同源区域（PHR ）和长度、序列各异的竣基端
（CCT ）邸］。

隐花色素在植物中主要作为蓝光和近
紫外光的受体，参与光形态的建成、抑制下胚轴的
伸长，促进子叶扩张，调节开花时间，调节气孔开
放，参与生物钟的调控，感知磁场，甚至是细胞凋
亡，等等孔
三角褐指藻是一类广温广盐性的浮游硅藻，作 为羽纹纲硅藻的代表物种，是一种重要的饵料藻。

福建轻纺2019年12月第12期屯X
三角褐指藻的全基因组测序已经完成叫目前三角褐指藻隐花色素光解酶家族中仅对CPF1和CryP有所研究。

三角褐指藻CPF1表现出6-4光产物修复活性，并且在异源哺乳动物细胞中可作为生物钟的转录抑制因子，且在蓝光调节中起着重要作用叼。

在三角褐指藻基因组分析中，植物隐花色素的典型序列并未被发现，但发现了一种与高等植物和绿藻隐花色素在进化上成群的蛋白，这种蛋白被称为PtCryP，三角褐指藻PtCryP蛋白具有隐花色素的典型特征，即具有结合FAD和5,10-MTHF的特性⑷，通过反义RNA技术而构成的ROyP knockdown敲除突变体的转录组分析，发现在三角褐指藻中存在CryP与其他光感受器的调控信号网络[11]o
基因敲除是基因功能研究和基因调控最重要的手段之一°CRISPR-Cas9作为一种新型的基因编辑技术，能对基因组进行准确的定点修饰，该方法容易操作，且成本低g°CRISPR-Cas9技术目前已经广泛应用于各种生物的基因编辑，在其它微藻中也有成功案例[13]o迄今为止，还没有利用CRISPR-Cas9技术对三角褐指藻丹QyP基因进行敲除及更深入的研究。

本研究从三角褐指藻中克隆得到PQyP基因，并对PtCiyP基因的序列进行生物信息学分析，且构建BCiyP的CRISPR-Cas9敲除质粒，为研究三角褐指藻的感光过程和光信号转导途径奠定分子生物学基础。

1材料与方法
1.1材料
三角褐扌旨藻(Phaeo比c切mn tncomutum)购于中国科学院藻种库；敲除载体pKS diaCas9-sgRNA购于Addgene;克隆载体pMD-19T、T4DNA连接酶、DNA Marker购于Takara公司；限制性内切酶Bsal购于NEB公司；TransTaq DNA Polymerase High Fidelity聚合酶、TransZol Up Plus RNA Kit、TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA synthesis SuperMix反转录试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；质粒DNA小量提取试剂盒‘Universal DNA纯化回收试剂盒购于北京天根生化科技有限公司；菌液PCR所用2x T5Super PCR Mix(Colony)购于北京擎科新业生物技术有限公司；其他常规试剂均为国产分析纯。

采用f/2培养基培养三角褐指藻。

本研究中所使用的引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2方法
1.2.1三角褐指藻总RNA的提取
三角褐指藻在灭菌后的含有f/2培养基的天然海水中，温度为20°C，光照为4000lx，光暗周期为12:12h条件中培养。

三角褐指藻培养至对数生长期时，取40mL三角褐指藻细胞，4C、8OO0g离心4min,根据TransZol Up Plus RNA Kit的方法提取三角褐指藻细胞的总RNA，并经2%琼脂糖凝胶电泳及NanoDrop-2000分光光度仪检测RNA的浓度及质量后，储存于-80C待用。

1.2.2三角褐指藻PtCryP基因的扩增
根据GenBank数据库中三角褐指藻RCiyP的基因序列(XM_002184521.2)，利用Primer Premier5软件设计一对引物(PF和PR)。

以总RNA反转录获得的cDNA为模板，以设计的PF和PR为引物(表1)，在94C 预变性5min;94C变性30s,55C退火30s，72C延伸90s，30个循环；72C延伸10min条件下进行PCR 扩增。

扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，用DNA纯化回收试剂盒回收目的片段。

将目的片段连接于pMD19T载体上，转化至大肠杆菌DH5a中，并用氨卞青霉素抗性平板筛选得到阳性单克隆，然后经质粒PCR和酶切鉴定得到重组克隆。

所得重组克隆由生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.2.3三角褐指藻PtCryP基因的生物信息学分析
运用BioEdit软件对三角褐指藻PQyP基因的核
喘卜赵靖悦，龚林，雷娜娜，陈由强，何文锦：三角褐指藻丹5^基因的克隆及敲除载体构建
昔酸序列进行分析。

利用在线工具和相关软件对蛋白质序列进行理化性质分析(https:///protparam/);
禾寸用N C BI保守结构域数据库(CDD)的CD-search 进行蛋白质的保守结构域分析(https://www.ncbi.nlm. /Structure/cdd/wrpsb.cgi);
蛋白的疏水性分析(https://web.expasy. org/protscale/);
跨膜区结构预测(http://www.cbs.dtu. dk/services/TMHMM/);
信号肽预测(http://www.cbs.dtu. dk/services/SignalP—4.0/);
亚细胞定位预测(. cn/bioinf/Cell—PLoc—2/);
磷酸化位点预测(http://www.dabi.temple. edu/disphos/);
糖基化位点预测(http://www.cbs.dtu. dk/services/YinOYang/);
蛋白质的二级结构预测(https://www. /);
利用SWISS-MODEL程序构建预测蛋白质三维空间结构(https:///);
利用MEGA7.0软件中的ML(Maximum likelihood)法构建系统进化树，进化树中使用蛋白质序列号及所属物种名称见表2。

1.2.4三角褐指藻RQyP Cas9敲除质粒的构建
在CRISPR结构设计网站(http://cnspr.dbcls.jp/)
Phaeo血皿comutum genome,ASM15095v2 (Feb,2010)数据库，针对三角褐指藻RQyP基因的DNA序列(XM-002184521.2),结合基因测序结果及GenBank数据库上的基因序列，考虑单核昔酸多态性问题，寻找包含Cas9识别位点PAM序列的片段，
对CRISPR/Cas9靶点进行预测。

根据sgRNA序列必须位于基因外显子区域的原则，以PAM序列之前20nt的序列作为敲除靶位点序列，在预测结果中筛选出特异性高的、合适的sgRNA 序列，根据需要得到含有5'TCGA和AAAC突出端作为衔接子的寡核昔酸链的原则口4】，设计引物sgRNA1/2/3/4—F/R(表1),引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

将每对寡聚核昔酸序列，以100“mol/L的浓度 等比例混合，37°C连接30min,95°C加热5min,然后缓慢降温，得到双链形态的DNA。

取5“L退火形成的双链DNA,100ng经Bsa I酶处理后的线性化pKS diaCas9—sgRNA质粒，2»L T4连接酶，1x T4DNA 连接酶缓冲液，用水补足20“L,16C连接过夜，
表1引物序列
引物名称引物序列(5，—3，)目的
PF GGAATTCATGTCCAGCTCTTTCAGCAA扩增PtC r yP序列
PR GCTCTAGATTACAACGCTTCAGGATCGT扩增PtC r yP序列
sgRNA1-F TCGAGACGTTCTTTACGATTGGCG构建敲除质粒使用的sgRNA
sgRNA1-R AAACCGCCAATCGTAAAGAACGTC构建敲除质粒使用的sgRNA
sgRNA2-F TCGAGGGCGGTAGTTGACTTGCGG构建敲除质粒使用的sgRNA
sgRNA2-R AAACCCGCAAGTCAACTACCGCCC构建敲除质粒使用的sgRNA
sgRNA3-F TCGAGGTCGCTGCGATCGATCGGT构建敲除质粒使用的sgRNA
sgRNA3-R AAACACCGATCGATCGCAGCGACC构建敲除质粒使用的sgRNA
sgRNA4-F TCGAGGGGAACTGCTCGTTCGGAT构建敲除质粒使用的sgRNA
sgRNA4-R AAACATCCGAACGAGCAGTTCCCC构建敲除质粒使用的sgRNA
M13R CAGGAAACAGCTATGAC检测sgRNA是否插入pKS diaCas9-sgRNA sg片段插入检测-F CTGCAGGTTGGCTCGGAAG检测sgRNA插入片段是否正确
sg片段插入检测-R TGACATACGATAGCATGGGTGAG检测sgRNA插入片段是否正确
福建轻纺2019年12月第12期屯X
表2进化树所用物种名称及蛋白序列号
物种名称蛋白名称序列号
拟南芥Arabidopsis thaliana cryptochrome3NP_568461.3
拟南芥Arabidopsis thaliana cryptochrome1NP_567341.1
拟南芥Arabidopsis thaliana cryptochrome2NP_171935.1
莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtH cryptochrome DASH1XP_001701871.1莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtH cryptochrome DASH2XP_001690052.1莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtH cryptochrome photoreceptor XP_001698054.1胶球藻Coccomyxa subellipsoidea cryptochrome XP_005646725.1胶球藻Coccomyxa subellipsoidea cryptochrome XP_005650440.1斑马鱼Danio rerio cryptochrome DASH NP_991249.1
镜马鱼Danio rerio cryptochrome1NP_001070765.2斑马鱼Danio rerio cryptochrome2NP_571867.2
人Homo sapiens Cryptochrome2AAH41814.1
人Homo sapiens Cryptochrome1AAH30519.1
烟草Nicotiana tabacum cryptochrome DASH XP_016459085.1飓阜Nicotians tabacum cryptochrome1AGU41987.1
烟草Nicotians tabacum cryptochrome2AGU41986.1
金牛驼球藻Ostreococcus tauri CRY DASH-likeprotein CAL50547.1
金牛驼球藻Ostreococcus tauri Cryptochrome/DNA photolyase XP_003074697.2金牛驼球藻Ostreococcus tauri cryptochrome DASH OUS42345.1
金牛驼球藻Ostreococcus tauri cryptochrome-like protein1CAL53781.1
玉米Zea mays Cryptochrome DASH PWZ05025.1
玉米Zea mays cryptochrome2NP001183937.1
得到完整闭合的重组质粒，分别命名为pKS diaCas9-sgRNA1，pKS diaCas9-sgRNA2,pKS diaCas9-sgRNA3,pKS diaCas9-sgRNA4。

将上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a,涂布于含1mg/mL 氨卞青霉素的固体LB平板上，37C培养过夜。

挑取单克隆菌落分别接种于含1mg/mL氨卞青霉素的LB液体培养基中，37C恒温振荡培养，使用质粒小提试剂盒提取质粒后，使用引物sgRNA1/2/3/4-F和引物M13R进行菌液PCR验证（表1）,验证sgRNA片段是否成功插入pKS diaCas9-sgRNA载体。

菌液PCR验证成功后，使用引物为sg片段插入检测-F和sg片段插入检测-R进行PCR（表1）,PCR产物送上海生工生物工程股份有限公司测序。

2结果与分析
2.1三角褐指藻P/GyP基因的克隆
通过PCR扩增，获得一条接近2000bp的DNA片段（图1）,与目标DNA的大小相近。

将该DNA片段送上海生工有限公司测序,测序的结果为1575bp,进行比对后，
序列一致。

发现该核昔酸链的序列与目标DNA的
注：M:DL2000DNA Marker;l:PtCryP 图1HC/yP基因的PCR产物凝胶电泳图
2.2三角褐指藻PtCryP的生物信息学分析
2.2.1三角褐指藻PtCryP蛋白的理化性质分析
经Bioedit软件分析，三角褐指藻PQyP基因的
蜃〉赵靖悦，龚林，雷娜娜，陈由强，何文锦：三角褐指藻BQyP基因的克隆及敲除载体构建
cDNA序列全长为1575bp,编码524个氨基酸（图2）o使用Protparam程序在线分析，该蛋白的等电点为8.30,分子式推测为C2606H4084N766O770S16,蛋白质分子量为58.98kDao不稳定指数为50.12,推测该蛋白为不稳定蛋白。

预测在酵母中表达的半衰期大于20h,在大肠杆菌中表达的半衰期大于l0h,而在哺乳动物网状细胞中体外培养表达的半衰期为30h o该蛋白由20种基本氨基酸组成,含量较高的氨基酸残基是丙氨酸（Ala,9.4%）,精氨酸（Arg,9.4%）和亮氨酸（Leu,9.9%）,含量较低的氨基酸残基是半胱氨酸（Cys, 1.7%）和苯丙氨酸（Met, 1.8%）。

其带正电荷氨基酸有65个（Arg+Lys）,带负电荷的氨基酸有62个（Asp+Glu）。

经过protscale程序在线分析，氨基酸序列疏水性/亲水性预测结果表明，平均疏水系数为-0.393,小于0,推测其为亲水性蛋白，其脂肪系数为83.44。

2.2.2三角褐指藻PtCryP蛋白的保守结构域、信号肽、磷酸化位点和糖基化位点分析
NCBI保守结构域数据库（CDD）分析表明，该蛋白属于FAD_binding_7super family,与预测该蛋白的功能相一致（图3）。

TMHMM预测该蛋白处于膜外该蛋白不存在跨膜结构域（图略）。

禾U用Cell—PLoc 2.0进行亚细胞定位预测，PtCryP定位于线粒体中（图略）。

经过SignalP4.0在线预测，蛋白不存在信号肽序列（图略）。

经软件DISPHOS预测PtCryP蛋白上有19个磷酸化位点，其中10个丝氨酸磷酸化位点、8个苏氨酸磷酸化位点、1个酪氨酸磷酸化位点（图4A）。

经软件YinOYangl.2预测PtCryP蛋白中存在O-GlcNAc糖基化位点，位置在第2、3、64、70、155、211、240、341、345、416、507、514个氨基酸残基处（图4B）。

图2HCryP基因的核昔酸序列和推测的氨基酸序列
show extra options»
Conserved domains on[gi12191287261ref|XP_002184557」|]
predicted protein[Phaeodactylum tricomutum CCAP105S/1]
Search for similar domain architectures|®Retlne search
FAD otnding domain of D NA photolyase:
图3PtCryP蛋白保守结构域分析
B
；Serine丝氨酸
；Threonine苏氨酸
■Tyrosine酪氨酸YinOYang 1.£：predicted0-(beta)-GlcNAc sites in PtCryP
注：E：O-GlcNAc potential（潜在O-糖基化位点）；
Threshold（临界值）。

图4三角褐指藻PtCryP蛋白的（A）磷酸化和（B）糖基化位
点预测
福建轻纺2019年12月第12期忍X
注：Linel的深色部分代表线状结构区域，浅色部分代表螺旋结构区域；
Line2的深色部分代表暴露在外的区域，浅色部分代表掩埋于内部的区域。

图5三角褐指藻PtCryP蛋白二级结构
2.2.3三角褐指藻PtCryP蛋白的二级结构与三级结构分析
通过PredictProtein分析蛋白质的二级结构的结果显示该基因编码蛋白序列a-螺旋（Helix）所占比例为35.1%,无规则卷曲（Loop）所占比例为58.2%,延伸链区（Strand）所占比例为6.7%（图5）。

由此可知，a-螺旋和无规则卷曲是三角褐指藻PtCryP蛋白二级结构的主要组成，属于混合型蛋白。

在二级结构分析结果的基础上，进一步采用SWISS-MODEL进行蛋白质的三级结构同源建模，PtCryP蛋白三级结构预测结果如图6。

图6SWISS-MODEL对三角褐指藻PtCryP蛋白三级结构的
预测
2.2.4三角褐指藻PtCryP蛋白的系统进化分析
通过构建不同物种来源隐花色素的进化树（图7）,发现三角褐指藻来源的PtCryP蛋白与其他真核单细胞藻类（莱茵衣藻和金牛驼球藻）序列比较相似，形成姐妹群，且发现三角褐指藻PtCryP蛋白序列更接近于DASH类隐花色素。

------Danio reno cryptochrome DASH(NP991249.1)
Danio reno cryptochrome1(NP001070765.2)
注：黑色原点标记为三角褐指藻CryP -•Phaeodactylum tncomutum cryP(XP002184557.1)
Arabidopsis thaliana cryptochrome2(NP567341.1)
图7PtCryP蛋白的同源进化树分析（最大似然法）
2.3三角褐指藻P/C/yP基因的敲除载体构建
根据以上PQyP基因及PtCryP蛋白生物信息学分析结果，为了进一步验证其生物学功能，我们构建PQyP基因的敲除载体。

将退火后形成的双链DNA 中，插入Esa/酶线性化后的质粒pKS diaCas9-sgRNA,使用引物sgRNAl/2/3/4—F和引物M13R进行菌液PCR验证，验证结果如图8A,挑取的菌落均检测到约550bp的目的条带，证明sgRNA片段均成功插入pKS diaCas9-sgRNA载体中。

使用sg片段插入检测-F和sg片段插入检测-R进行PCR,送测序，测序结果如图所示，说明靶位点DNA片段成功地插入了pKS diaCas9-sgRNA载体中，且插入的片段序列正确。

将得到的阳性克隆命名为pKS diaCas9-sgRNA1,
喘〉赵靖悦，龚林，雷娜娜，陈由强，何文锦：三角褐指藻RQyP基因的克隆及敲除载体构建
（A）pKS diaCas9-sgRNA1/2/3/4菌液PCR验证：M，DL1000DNA marker；1和2，pKS
diaCas9-sgRNA1；3，4和5，pKSdiaCas9-sgRNA2；6，7和8，pKSdiaCas9—sgRNA3；9
和10，pKSdiaCas9—sgRNA4。

（B）pKS diaCas9—sgRNA1/2/3/4阳性克隆的测序结果:方框中显示插入的sgRNA片段。

图8pKS diaCas9-sgRNA1/2/3/4重组质粒的验证
pKSdiaCas9—sgRNA2,pKSdiaCas9—sgRNA3,pKS diaCas9—sgRNA4。

3讨论
本实验从三角褐指藻中克隆得到了ROyP基因的cDNA序列,并通过多种生物信息学手段对其进行了理化性质分析、二级结构预测、三级结构建模、磷酸化位点预测、序列比对、系统进化树的构建等，得知该基因cDNA全长为1575bp,编码524个氨基酸，预测蛋白质的等电点为8.30,预测的蛋白质分子量为58.97872kDa,且为不稳定蛋白。

三角褐指藻PtCryP蛋白通过保守结构域分析,具有DNA光裂解酶FAD结合的结构域,该结构域存在于所有隐花色素/光裂解酶家族蛋白。

拟南芥隐花色素PHR结构域一般约由500个氨基酸残基组成,且拟南芥CRY-DASH蛋白缺失CCT结构域问,而三角褐指藻PtCryP蛋白由524个氨基酸组成,且缺失CCT 结构域,与拟南芥CRY-DASH蛋白在结构上非常相似。

在拟南芥中，隐花色素的调控机制研究得较为深入，未激活的隐花色素在接受蓝光信号之后激活FAD发色团，PHR结构域发生同源二聚化，PHR和CCT结构域解离，引发隐花色素蛋白构象变化，变成光激活状态的隐花色素，而CCT结构域发生光依赖的磷酸化反应［16'17］e由此可知，无论是PHR结构域的二聚化或者CCT结构域的磷酸化反应都需要有磷酸化的发生。

蛋白质磷酸化是一种常见的翻译后修饰方式,可通过磷酸化与去磷酸化影响蛋白质的活性与功能，因此磷酸化分析对研究蛋白质的功能研究具有重要意义冋。

本研究通过磷酸化位点预测,在三角褐指藻的PtCryP蛋白中发现了19个可能的磷酸化位点，为后续磷酸化机制的功能研究提供了重要线索。

基因的功能与其亚细胞定位密切相关。

拟南芥隐花色素必刃和口匕?基因在被检测过的所有细胞类型和所有细胞器中都有表达［19］。

而拟南芥隐花色素CRY3则表达于叶绿体和线粒体中［16］,细胞定位不同的隐花色素表现出不一样的功能［20］。

利用茨光蛋白标记方法进行亚细胞定位，发现短凯伦藻(K虹e说a brevis)的c巧-D4SH表达于叶绿体中［15］,而克氏锥虫(T切anoma cruzi)的砂表达于线粒体中［22］。

通过亚细胞定位软件分析，预测三角褐指藻PtCryP蛋白定位于线粒体中，根据其定位，与在线粒体内表达的拟南芥隐花色素可能有功能上的相似，为我们研究功能及分类提供了线索。

福建轻纺2019年12月第12期忍X
为了进一步研究三角褐指藻丹砂基因的功能,目前已有研究对三角褐指藻P5P基因利用反义RNA 方式沉默其表达［10，11］,而未使用CRISPR-Cas9的方法对PQyP基因进行敲除，从而从DNA水平上彻底阻断基因的表达，本文成功构建了三角褐指藻PtCiyP基因的CRISPR-Cas9敲除载体pKS diaCas9-sgRNA1/2/3/4,为三角褐指藻PrOyP基因的功能及其基因家族的信号传导的研究提供了基础。

三角褐指藻PtCryP蛋白显示的光谱特征、结合的发色团且参与光捕获蛋白的调控，这些特征与DASH型隐花色素更为相似［10］。

有研究对野生株和RCiyP敲除株在黑暗及蓝光下进行转录组分析，发现PtCryP蛋白对其他光感受器的表达会造成影响，这就意味着三角褐指藻中存在调节信号传导网络，而PtCryP蛋白在其中起着一定作用，且在硅藻基因组中没有找到植物隐花色素相互作用的基因COP1和SPA的同源基因，所以PtCryP蛋白的下游信号传导完全不同于植物隐花色素［11］o因此，我们需要进一步研究，三角褐指藻PtCryP蛋白的具体作用及它是如何传导信号等问题。

隐花色素是一类重要的蓝光受体，它参与光形态建成的调控，也能调控高等植物光周期的开花过程。

在拟南芥中隐花色素已经有了较深入的研究，但在单细胞藻类中，其研究才刚刚开始。

隐花色素家族基因是如何通过隐花色素感应蓝光从而调控藻类的生命活动？隐花色素通过与什么互作蛋白结合从而引发下游信号转导？在单细胞藻类中，隐花色 素是否参与生物钟节律的调控过程？这些都是等待解决的重要科学问题。

参考文献：
[1]Chaves,In e s,Pokorny R,Byrdin M,et al.The Cryptochromes:Blue Light Photoreceptors in Plants and Animals[J].Annual
Review of Plant Biology,2011,62(1):335-364.
[2]Ahmad M,Cashmore A R.HY4gene of A.thaliana encodes a protein with characteristics of a blue-light photoreceptor
[J].Nature,1993,366(6451):162-166.
[3]Lin C.Arabidopsis cryptochrome1is a soluble protein mediating blue light-dependent regulation of plant growth and
development[J].Plant Journal for Cell&Molecular Biology,2010,10(5):893-902.
[4]Lin C,Robertson D,Ahmad M,et al.Association of flavin adenine dinucleotide with the Arabidopsis blue light receptor
CRY1[J].Science,1995,269(5226):968-970.
[5]Konig SJuhas MJager S,et al.The cryptochrome-photolyase protein family in diatoms[J].Journal of Plant Physiology,
2017,217:S0176161717301761.
蜃赵靖悦，龚林，雷娜娜，陈由强，何文锦：三角褐指藻ROyP基因的克隆及敲除载体构建
[6]Todo T.Functional diversity of the DNA photolyase/blue light receptor family[J].Mutation Research/dna Repair,
1999,434(2):89—97.
[7]朱春利，张桂荣,蔡爱军，等.植物隐花色素结构与功能研究进展[J].基因组学与应用生物学,2009,28(1):174—178.
[8]Bowler C,Allen A E,Badger J H,et al.The Phaeodactylum genome reveals the evolutionary history of diatom genomes[J].
NATURE,2008,456(7219):239—244.
[9]Coesel S,Mangogna M,Ishikawa T,et al.Diatom PtCPF1is a new cryptochrome/photolyase family member with DNA
repair and transcription regulation activity[J].E M BO REPORTS,2009,10(6):655—661.
[10]Juhas M,Von Zadow A,Spexard M,et al.A novel cryptochrome in the diatom Phaeodactylum tricornutum influences
the regulation of light-harvesting protein levels[J].FEBS Journal,2014,281(9):2299—2311.
[11]Konig,Sarah,Eisenhut M,et al.The influence of a cryptochrome on the gene expression profile in the diatom Phaeodactylum
tricornutum under blue light and in darkness[J].Plant&Cell Physiology,2017,58(11):1914—1923.
[12]Ran F A,Hsu P D,Wright J,et al.Genome engineering using the CRISPR—Cas9system[J].Nature Protocols,2013,
8(11):2281—2308.
[13]Gaj T,Gersbach C A,Barbas C F.ZFN,TALEN,and CRISPR/Cas—based methods for genome engineering[J].Trends
in Biotechnology,2013,31(7):397—405.
[14]Nymark M,Sharma A K,Sparstad T,et al.A CRISPR/Cas9system adapted for gene editing in marine algae[J].Scientific
Reports,2016(6):24951.
[15]Brunelle S A,Hazard E S,Sotka E E,et al.Characterization of a dinoflagellate cryptochrome blue-light receptor with a
possible role in circadian control of the cell cycle[J].Journal of Phycology,2007,43(3):509—518.
[16]Shalitin D,Yang H,Mockler T C,et al.Regulation of A rabidopsis cryptochrome2by blue—light—dependent phosphorylation
[J].Nature,2002,417(6890):763—767.
[17]Liu H T,Liu B,Zhao C,et al.The action mechanisms of plant cryptochromes[J].Trends in Plant Science,2011,16(12):684—
691.
[18]姜铮，王芳，何湘，等.蛋白质磷酸化修饰的研究进展[J].生物技术通讯,2009,20(2):233—237.
[19]Kunkel T,Neuhaus G,Batschauer A,et al.Functional analysis of yeast derived phytochrome A and B phycocyanobilin
adducts[J].The Plant Journal,2002,10(4):625—636.
[20]Kleine T,Lockhart P,Batschauer A.An Arabidopsis protein closely related to Synechocystis cryptochrome is targeted to
organelles[J].The Plant Journal,2003,35(1):93—103.
[21]Wang,H.X.A Golgi-localized Hexose Transporter Is Involved in Heterotrimeric G Protein-mediated Early Development
in Arabidopsis[J].Molecular Biology of the Cell,2006,17(10):4257—4269.
[22]M.Carolaing Gabald o n,Labrador L,Arraiz G,et al.Trypanosoma cruzi:A kinetoplast—associated protein of the
photolyase/cryptochrome family[J].Experimental Paras i t o logy,2010,124(3):350—356.。