糖芯片的检测及应用

糖芯片的检测及应用
黄河贾红英侯信*
(天津大学材料科学与工程学院天津300072)
摘要糖芯片技术具有样品少、通量高和特异性强等优点,是一种糖组学研究的新的技术平台和强大的分析工具,已经广泛用于糖和蛋白质的特异性作用、酶活性和抑制剂、病毒入侵机理、细菌检测和免疫反应等方面的研究。

本文简要介绍了糖芯片的原理、制备和信号的检测技术(荧光标记法、质谱法、SPR法等),分析了糖芯片在各个领域的应用及其发展前景。

关键词糖芯片糖生物学荧光标记免疫反应
Detection and Application of Carbohydrate Microarrays
Huang He,Jia Hongying,Hou Xin*
(School of Materials Science and Engineering,T ianjin University,Tianjin300072)
Abstract The biological si gni ficance of glycans in the pos-t genomic era requires the develop ment of new technologies to enable functional s tudies of carbohydrates in a high-throu ghput manner.Recently,carbohydrate microarrays,as a new kind of promising biologica-l chip following the gene microarray and protein microarray have been exploi ted as an advanced technology for this purpose.It will highly promote the develop ment of glycobiology due to the advantages of carbohydrate microarray such as less dosage of samples,higher specificity and high-throughput.In this paper,progress in the detection methods of hybridizes information of carbohydrate microarrays and their potential applications for functional glycomics are in troduced.The future trend of carbohydrate microarray is also discussed.
Keywords Carbohydrate microarray,Glycobiology,Fluorescent labeling,Im mune response
糖芯片是在基因芯片和蛋白芯片的基础上诞生的,其基本原理与基因芯片和蛋白芯片相似,都是基于物质之间的特异性作用[1]。

它是将多个不同结构的糖分子通过共价或非共价作用固定于经化学修饰的基质上,进而对蛋白质、糖蛋白等待测样品进行测试、分析的一类分析方法[2]。

由于生物体细胞表面被各种形式的多糖或糖复合物所覆盖,这些糖基复合物不仅在细胞识别、细胞粘附、细胞间信号传导等方面具有重要的作用,而且在细胞病变、病原感染等过程中亦有重要意义[2],因此糖芯片的出现为糖生物学、免疫学和疾病诊断的研究提供了一种强有力的分析手段,在糖蛋白鉴定、糖-蛋白特异性结合的分析、受体糖结合位点的鉴定、免疫学研究、筛选药物等许多领域具有良好的应用前景[3]。

随着糖芯片技术的不断发展,与此相适应的信号检测方法,如荧光标记法、化学发光法、质谱法和表面等离子共振(SPR)光谱法等检测手段在糖芯片技术中的应用也得到了迅速的发展。

1糖芯片的制备
糖芯片技术是由Fukui等[4]首先报道的,他们以硝酸纤维素膜为基板制成糖芯片。

糖芯片的制备一般包括3个过程:(1)把糖或糖基复合物连接到基板上制成糖探针;(2)把靶样(蛋白质、RNA或细胞)和糖探针相结合;(3)检测结合的信号[5]。

其中,糖探针的制备有原位合成和直接点样两种方法,原位合成一般是通过光引导的方法直接在化学修饰过的基板上进行合成,而点样法则是先合成然后再用点样仪将其点样到基板上[6]。

在糖芯片制备中,糖在基板表面的固定是非常重要的一步。

目前有3种方法
黄河男,24岁,硕士生。

从事生物材料的研究。

*联系人E-mail:houxin@
国家自然科学基金项目(50403017)资助
2008-03-26收稿,2008-10-18接受
可用来固定糖类:(1)将未修饰的糖以非共价、无特异性作用位点的方式固定到未进行表面处理的基板上,但由于该方法仅适于分子量较大的糖或糖复合物,且非共价结合程度不好控制,导致后面荧光标记和冲洗时很容易丢失数据,因而具有一定的局限性;(2)将化学修饰过的糖以共价、作用位点特异的方式固定于未进行表面处理的基板上;(3)将化学修饰过的糖以共价、作用位点特异的方式固定于表面处理
过的基质上[3]。

2 糖芯片反应信号的检测
糖芯片反应信号的检测是获取固定在芯片上探针信息变化的过程,是糖芯片相关技术的一个重要组成部分。

从检测手段上,可以将糖芯片的检测分为有标记和无标记两类,有标记法通常需要对探针或样品分子进行标记,以便利用光、电、磁等性质检测,常见的标记有荧光标记、电化学标记、同位素标记等,标记法可以提高检测的灵敏度,但是高成本和复杂的操作程序,也可能影响自然的识别过程。

无标记法是直接观察待测分子发生反应前后本身性质,如重量、介电性质、光学性质等的改变,但是需要如质谱、表面等离子体共振谱仪等昂贵的仪器设备,检测成本较高[7]。

图1 荧光标记检测法的操作示意图Fig.1 S cheme of the of fluorescent labeling detection
211 有标记物的检测方法
21111 同位素标记法 同位素标记是一种灵敏度高、应用广泛的检测手段,一般用于阵列密度较小的芯片,所需要的均为实验室常规使用设备,易于展开相关工作[8]。

但与荧光标记法等相比,其在信号检测时一些反应信号强的点阵容易产生光晕而干扰周围信号的分析,所以在芯片检测分析时用得不多。

21112 荧光检测法 荧光检测法是将荧光染料(如C y3、Cy5等)标记的靶样与糖探针反应,再用冲洗液冲洗已经发生作用的芯片,除去多余荧光素的干扰,然后用CCD 照相技术及激光扫描系统等对结合到芯片上的靶样所发出的特定信号进行检测,它具有高通量、高分辨、定位功能强和操作稳定性好等优点,是糖芯片反应信号检测技术中应用最广泛的一种。

当糖探针与靶样完全反应时产生的信号强度最强,不完全反应时荧光信号较弱,不能发生特异反应则检测不到或只能检测到芯片原有的荧光信号[9],所以通过采集各反应点的荧光位置、荧光强度,再经过相关软件对图象进行分析,就可获得有关生物信
息[10],其基本操作流程如图1所示[11]。

Krull 等[12]以共价方式固定在石英光纤表面的甘露糖为探针,与溶液中的凝集素杂交,再与荧光嵌入染料溴乙啶(EB)反应,根据荧光强度与溶液中发生反应靶样的量的正比关系进行分析,检测出了待测凝集素;但是,由于只要有荧光标记的物质结合到探针阵列上都会发出阳性信号,且糖含有大量的羟基,与待测靶样作用的位点比较多,难以判断发生的反应是否为探针和靶样的配对或是否为正确的配对,所以检测灵敏度较低。

为此,需要对荧光标记和分析过程进行改进。

多重颜色荧光素标记比照实验[13]是比较常用的一种改进方法。

Kuo 等[14]将待测靶样刀豆凝集素Con A 用C y5荧光素标记,对照样木菠
萝凝集素jacalin 用Cy3荧光素标记,然
后把待测的靶样和对照样都同时和同
一甘露糖芯片进行作用,用共焦扫描荧
光探测器测定,发出红光的点样是待测
靶样,发出绿光是对照样,发出黄光则
是待测靶样和对照样共同作用的效果,
若点样是黑色的则说明待测靶样和对
照样都没有和该探针发生作用。

结果
发现,甘露糖与Con A 存在特异性结
合,而与jacalin 没有反应。

212 无标记物的检测法
21211 质谱法 由于标记物可能会改
变待测物的结构和活性,所以,用标记法检测时,误差较大且灵敏度较低[15]。

质谱法是无标记的方法,可避免标记物带来的误差,具有较高的灵敏度。

到目前为止,质谱仍是糖生物学家应用最为广泛的研究糖链结构的工具。

其中快原子轰击质谱(fast atom bombardment mass spectrometry,FAB -MS)、电喷雾质谱(electrospray mass spectrometry,ES -MS)、基质辅助激光解吸离子化飞行质谱(matrix -assisted laser desorption ionization time -o-f flight mass spectrometry,MALDI -TOF -MS)是目前在糖链
结构测定方面广泛采用的3种质谱,它们可以直接对样品进行离子化和解析作用以获得信息[16]。

Zhang
等[17]通过对一系列的N -连接寡糖和O -连接寡糖的检测,发现应用这种技术产生的糖链片段非常少,可以完整地分析其结构,而且具有很高的敏感度。

质谱法测定糖芯片的另一个优点是可以和其他的分离设备(如蛋白质分离设备、高效液相色谱HPLC 、毛细管电泳CE 等)联用,经HPLC 和CE 分离得到的糖蛋白或寡糖可以直接进入质谱仪进行结构分析,从而避免了样品转运过程中的污染和损失,提高了分析效率和准确度。

Heintz 等[18]先用液相色谱仪分离由胰蛋白酶催化合成的多肽链,然后把各个化合物分别和糖芯片进行相互作用,用质谱仪分析,鉴定出了磷酸蛋白。

再有,质谱法不仅能够测定糖链的结构,而
且可以测定糖链在糖复合物中的定位。

Harazono 等[19]先将人类载脂蛋白B100用不同的蛋白酶水解得
到不同大小的肽段,然后用液相色谱分离所得到的肽段,再将分离后的肽段直接放入质谱仪进行测定,获得了载脂蛋白Bl00的糖基化位点信息。

图2 SPR 检测的工作原理
Fig.2 Scheme of the SPR detection 21212 表面等离子共振光谱法(SPR) SPR 检测的突出优
点是待测物无需标记,能适用于混浊、不透明或者有色溶
液,且能实时、连续监测反应动态过程[20]。

SPR 光谱法作为
无标记法能快速对抗体-抗原以及糖和蛋白之间的特异性
反应进行检测。

上世纪90年代,糖生物学家就将这项技术
用于监测凝集素和固定化糖在玻片表面的相互作用[21]。

SPR 技术是利用物理光学的原理,在研究两分子相互作用
时,将一种分子固定在传感片表面,而含有另一种分子的溶
液流过其表面,两种分子的结合会使传感片表面的折射率
改变,从而导致表面等离子共振条件的变化。

通过检测共振角或共振波长的变化来检测待测分子的成份、浓度以及
参与化学反应的特性[22],其检测原理如图2所示[23]。

Ratner 等[24]将修饰后的一系列高甘露糖固定制成
糖芯片,研究其与蓝藻抗病毒蛋白-N(cyanovirin -N,CVN)之间的相互作用,结果发现,用SPR 检测的结果与用荧光素标记法检测的结果完全一致。

SPR 在糖芯片中的应用为糖组学研究提供了一种有力的研究工具,人们可以用它快速测定糖与凝集素或蛋白质之间的特异性作用,还可以高通量筛选分析这种特异性作用的增强剂或抑制剂。

Smith 等[25]将硫醇修饰的糖固定于金膜的表面,然后用SPR 技术分别分析Con A 与甘露糖和jacalin 与半乳糖的相互作用,测量凝集素与糖修饰的膜表面结合的吸附系数和相互作用的平衡常数。

结果表明,甘露糖与ConA 的结合要比半乳糖和jacalin 的结合更为紧密。

3 糖芯片的应用
由于细胞表面被各种形式的多糖或糖复合物所覆盖,细胞表面的多糖或糖复合物不仅对于生物体是必需的,同时也被各种细菌和病毒用来侵入和感染其宿主细胞[26]。

因此,糖芯片的研究,对于流行病的诊断监测、病原微生物内毒素的识别与鉴定以及常见的糖与靶蛋白特异性结合的研究具有重要的意
义[27]。

311 糖-蛋白质相互作用研究
糖和蛋白质的相互作用在生物体内发挥着重要的生物学作用,所以对糖和蛋白质相互作用的分析就显得尤为重要,过去主要采取生物物理和化学方法来研究,而缺少高通量的分析方法。

糖芯片作为一种新发展的高通量检测技术,能用来对糖和蛋白质的相互作用进行分析,并能对特异的糖结合蛋白进行识别和表征。

Fukui 等[4]
用寡糖芯片对糖-蛋白质的相互作用进行了高通量的检测和特异性界定。

糖识别蛋白不
仅能从结构明确的同源寡糖阵列中识别出其配体,也能从来源于脑糖蛋白的异源O-多糖阵列中筛选出其配体。

Houseman等[28]利用含有10个不同单糖探针的糖芯片解析了几种凝集素与糖的结合特异性,同时确定了可溶性糖对凝集素的抑制浓度,鉴定了B-1,4-半乳糖基转移酶的底物特异性。

Nimrichter 等[29]采用含有200个点的糖芯片研究鸡肝细胞对糖的吸附情况,发现表面含有C型凝集素的鸡肝细胞可以特异结合到以各种链接方式固定的N-乙酰葡萄糖胺残基的非还原性末端,而不能与半乳糖或N-乙酰半乳糖胺的非还原性末端结合。

Park等[30,31]通过将马来酰亚胺活化的糖固定在巯基修饰的玻片上,制备了糖芯片,用它们进行凝聚素结合实验。

结果显示,具有不同结构特征的糖能选择性地结合相应的凝聚素,其相对结合亲和力与液相实验结果具有良好的相关性。

另外,凝聚素与糖类结合亲和力也可以通过用糖芯片技术测定可溶性糖类的IC50值来进行定量分析。

C hristian等[32]通过氨基还原法将寡糖分子生物素化,并用生物素化的糖分子构建糖芯片,利用多种凝集素(糖蛋白)来研究检测糖蛋白特异作用。

将生物素化糖涂在链霉亲和素处理过的基板上,用重组人类C型凝集素(DC-SIGN)孵化,用氧化酶标记的免疫球蛋白多克隆抗体(IgG-Fc antidbody)检测与糖分子探针发生特异作用而被束缚的DC-SIGN,发现甘露糖分子被DC-SIGN特异结合。

312酶活性和抑制作用研究
酶在生物体中非常重要,各种酶的活性不仅对糖合成的产率有影响,更重要的是影响到糖链的结构。

因此,要获得某种功能的糖复合物,必须要寻找、分离、纯化得到高效和高度专一性的合成糖链的酶,同时要制备酶的抑制剂,便于用化学手段阻断非目标糖链的产生和研究糖复合物的生物学功能。

不过,酶商品化的困难及高的价格制约了糖链的大量合成,因此,发现并筛选出更多的廉价的糖链合成酶和制备相关酶的抑制剂就显得很重要[33]。

生物酶是从生物体中产生的具有催化功能的蛋白质,能和特定的糖探针发生作用而结合到糖芯片上,所以可用糖芯片对酶的活性进行检测。

Sung等[34]通过用二酰化的糖与连接到玻璃板上的环氧化合物偶联,制成了含有20个糖探针的糖芯片,分别和半乳酸转移酶作用将酶连接到糖探针上,然后在不同的(温度、湿度和pH)条件下选择特定的荧光标记凝聚素与其进行作用,用共焦扫描荧光探测系统分析其结合的强度,实现了对酶活性的检测。

唾液酸化Lewis X是炎症产生的重要靶向物质,而唾液酸化Le wis X的生物合成又必须要在岩藻糖基转移酶(FUTs)参与下才能进行,为了寻找岩藻糖基转移酶的抑制剂,B ryan等[35]将N-乙酰乳酸胺连接到糖探针上,在不同的候选抑制剂中与岩藻糖基转移酶相互作用。

结果发现有4种与探针分子反应的K i值非常小的凝聚素抑制剂。

313病毒入侵机理研究
病毒是依靠其表面的红血球凝聚素对宿主细胞表面的糖复合物进行识别,经细胞膜内陷形成吞噬泡,使病毒粒子进入细胞质中的[36],所以病毒入侵机理的研究对疾病的预防、疫苗和药物的开发具有重要的作用。

Ja mes等[37]用糖芯片研究了人类和禽类的H1和H3等多种感冒病毒的红血球凝聚素对糖受体的特异性结合,证明了人类和禽类受病毒感染的几率和难易程度是不同的,并进一步指出这种差异是由糖受体与硅酸末端连接的结构不同所引起的。

该方法为分析感冒病毒-受体特异性结合提供了依据,并为诸如禽流感H5N1等病毒作用机理的研究和疫苗的开发提供了一种很好的借鉴手段。

对艾滋病病毒HI V包膜糖蛋白gp120与宿主细胞的相互作用的研究有助于了解HI V病毒感染过程,并为设计干扰病毒进入细胞的疫苗和药物奠定基础。

Adams等[38]用寡糖芯片和糖蛋白芯片分析了糖蛋白gp120在阻碍抗体结合及转染宿主细胞方面的作用,并利用这些糖芯片,对树突细胞凝集素DC-SIGN、抗体分子2G12、C D4蛋白分子、蓝藻抗病毒蛋白N(cyanovirin-N)和scytovirin蛋白等5种gp120结合蛋白进行了逐个鉴定,并对结合效果进行了比较,明确了这些相互作用对糖的结构要求,发现高甘露糖型寡糖结构在gp120结合中有重要作用,为开发艾滋病治疗药物和疫苗提供了潜在的策略。

Hacia等[39]利用糖芯片检测遗传性乳腺癌和卵巢癌;把不同传染病的抗原或抗体制成芯片,通过免疫反应检测被感染个体血清中的抗体或外来病原体。

314细菌检测
由于细菌表面覆盖了大量的多糖或荚膜多糖、脂多糖、糖蛋白等糖基复合物,因此可以利用糖芯片来研究细菌-糖特异性作用和检测细菌,也为病原体的快速检测、食品卫生防疫等提供了一种潜在的策略。

Matthe w等[40]用葡萄糖、半乳糖、甘露糖、N-乙酰基-D-氨基葡萄糖和海藻糖等5个单糖的衍生物作为探针分别制成糖芯片,把荧光标记的埃希氏菌属大肠杆菌(Escherichia coli)和糖探针相互作用,冲洗糖芯片中未粘附的菌株,荧光检测发现大肠杆菌菌株ORN178与甘露糖分子发生特异吸附作用,因此可以用甘露糖将大肠杆菌菌株ORN178检测出来。

他们还进一步发现,大肠杆菌的不同菌株对甘露糖分子的亲和力不同,将大肠杆菌的不同菌株分别和甘露糖构建的糖芯片作用,结果发现,ORN178菌株与甘露糖的结合作用比ORN209菌株大。

因此也可用糖芯片来分离大肠杆菌中不同的菌株。

315免疫学研究
宿主细胞和病原微生物细胞表面的糖基复合物在很大程度上影响病原体的侵染,在疾病发生中起着关键作用;同时,又是宿主识别与响应的主要抗原结构。

某些病原微生物的表面抗原更是模拟宿主细胞的部分糖结构从而成为它们逃避宿主免役系统攻击的手段。

因此,通过糖芯片识别鉴定这类抗原结构可以研究病原微生物与宿主之间的相互关系,以便能够有效控制由此引起的传染性疾病[20]。

Galanina 等[41]将生物素修饰的复合糖固定在基质上,用糖芯片分析了抗体与抗原的结合特异性。

所得结果与普通的96孔板ELISA结果比较发现两者与已知的抗体特异性完全一致,但分析的敏感性和固定到基质板上的糖探针的量都不是很理想。

Narayanan等[42]分别从假鼻疽单胞杆菌(Burkholderia pseudomallei)和类鼻疽伯克霍尔德菌(Burkholderia mallei)中提取出荚膜多糖和脂多糖亚单位分子O-抗原多糖,经氨基转换后分别点样于玻璃片上制成糖芯片,然后利用荧光素Cy3和Cy5标记感染假鼻疽单胞杆菌的兔血清克隆免疫球蛋白二抗抗体,同样的方法标记感染类鼻疽伯克霍尔德菌的人免疫球蛋白G(IgG)二抗抗体,将标记后的抗体用糖芯片检测,发现均发生了明显的抗原-抗体识别反应。

Willats等[43]用多聚糖芯片对糖抗原和抗体间的特异结合进行了检测,发现单克隆抗体能识别芯片基质表面上相应的糖抗原,同时发现糖芯片技术的分析效率远远高于传统的ELISA(酶联免疫吸附)和微量滴定分析法。

Wang等[44]在此基础上用含有48个微生物糖探针的糖芯片对人体血清中的抗体的特异性结合进行了研究。

由于大部分病原体表面都含有特异性糖,所以用从病原体上提取的特异性糖制成糖芯片就可以用来诊断人是否感染了这种病原体[1]。

316测定糖的结构
基于蛋白质和糖的特异性反应,糖芯片技术能用来分析糖链的糖结构。

Feizi等[45]将糖芯片技术和质谱技术结合起来,把天然糖或人工合成的糖通过还原性胺偶联到氨基脂上得到所需要的拟糖脂(NGL),然后用高效液相色谱仪分离净化,再将分离后的拟糖脂连接到基质板上制成拟糖脂糖芯片,由质谱法对待测糖的结构进行分析,测出了待测寡糖的糖链结构。

4结语
糖芯片是继基因芯片和蛋白质芯片后发展起来的生物检测技术,具有检测样品少、高通量和特异性强等优点,是一种强大的分析工具,将会大大推动糖生物学及糖组学的发展[27]。

但糖芯片技术起步较晚,且糖分子本身结构复杂多样,糖与蛋白质的结合力很小,如何增强糖探针和待测蛋白的作用力仍是糖芯片技术中的一个难点。

在检测方法上,分析自动化、SPR光谱分析、芯片与质谱或其他分析手段联用等将成为以后发展的方向。

在应用方面,医学研究、药物筛选、临床诊断和疾病预防等都是糖芯片今后的发展方向。

当前,糖芯片虽然与人们的设想还有一定的差距,但相信随着生物芯片技术的发展,必将对推动农业、人口、健康和环境等核心问题发挥重大的作用。

参考文献
[1]陈忠斌.生物芯片技术.北京:化学工业出版社,2005.
[2]R Kleene,M Schachner.Nat.Rev.Neurosci.,2004,5(3):195~2081
[3]I Shin,S Park,M Lee.Chem.Eur.J.,2005,11(10):2894~2901.
[4]S Fukui.Seikagaku,2003,75(12):1545~1550.
[5]T Horlacher,P H Seeberger.Inter.Bio.,2006,10(4):490~498.
[6]闰实,韩金祥.中华肿瘤防治杂志,2002,9:473~477.
[7]赵新生.化学进展.2003,15:436~438.
[8]B Schwei tz er,P Predki,M Snyder.Proteomics,2003,3(11):2190~2199.
[9]黄晓峰,张远强,张英远.荧光探针技术.北京:人民军医出版社,2004.
[10]高志贤.现代仪器,2004,10:1~14.
[11]T K Pilobello,L Krishnamoorthy,D Slawek e t al.Che mBi oChe m.,2005,6(6):985~989.
[12]W R Algar,U J Krull.Anal.Chi m.Acta,2007,5(81):193~201.
[13]A Tucker,J Pattersonl.Nat.Biotechnol.,2006,9(9):24~25.
[14]W P Kuo,F Liu,J Trimarchi et al.Nat.Biotechnol.,2006,24(7):832~840.
[15]K Y Tomizaki,K J Us ui,H Mihara.Che mBi oChem.,2005,6(5):782~799.
[16]A Dell,H R Morri s.Science,2001,291(1):2351~2356.
[17]J H Zhang,L Lamotte,E D D odds e t al.Anal.Chem.,2005,77(3):4429~4430.
[18]D Hei ntz,V Wurtz,A V D orsselaer e t a11Elec trophoresis,2004,25(4):1149~1159.
[19]A Harazono,N Kawasaki,T Kawanis hi et a11Glycobiology,2005,15(5):447~462.
[20]聂立波,张黎明,侯清麟等.化学通报,2007,70(3):1~7.
[21]王山,李钰.细胞生物学杂志,2006,28:127~131.
[22]孙颖,张阳德.医学与哲学,2002,23:30~33.
[23]X M Z hu,P H Lin.Sens.Ac tuators B.,2002,84(3):106~112.
[24]D A Calarese,H K Lee,C Y Huang et a11Che m.Immunology,2005,102(38):13372~13377.
[25]E A Smith,M Kyo,H Kumasa wa et al.J.A m.Chem.Soc.,2003,124(24):6810~6811.
[26]薛彦峰,王秀奎,侯信等.化学进展,2008,20:149~154.
[27]G L Huang,X Y M ei,H X Zhang e t a11Appl.Microb.Biot.,2006,5(75):953~960.
[28]B T Houseman,M Mrksich.Che m.Biol.,2002,9(4):443~454.
[29]L Nimrichter,A Gargi r,M Gortler et a11Glycobi ology,2004,14(2):197~203.
[30]S Park,M R Lee,S J Pyo et al.J.A m.Chem.Soc.,2004,126(15):4812~4819.
[31]S Park,I Shi n.Angew.Chem.Int.Ed.,2002,114(17):3312~3314.
[32]H G Chris ti an,J V Sandra,E C Wiets ke et al.Anal.Biochem.,2006,354(15):54~63.
[33]高峰,杜冠华.高技术通讯,2006,16:624~628.
[34]S Park,I Shi n.O rg.Lett.,2007,9(9):1675~1678.
[35]M C Bryon,L V Lee,C H Wong.Bi oorg.Med.Che m.Lett.,2004,14(12):3185~3188.
[36]A E Smith,A Helenl us.Science,2004,304(2):237~242.
[37]S Ja mes,B Ola,G Laurel et al.Mol.Biol.,2006,355(5):1143~1155.
[38]E W Adams,D M Ratner,H R Bokes ch.ChemBiol.,2004,11(6):875~881.
[39]T Last,M Wahle,S Hacia et al.Superconduc tivity,2005,18(3):385~389.
[40]M D Di sney,P H Seeberger.Che mBi ol.,2004,11(12):1701~1707.
[41]O E Galani na,M Mecklenburg,N E Nifantiev et b.Chip.,2003,3(4):260~265.
[42]P Narayanan,D David,E Maril yn et al.Diag.Microb.Infec.Disease,2006,56(3):329~332.
[43]W G Willats,S E Rasmuss en,T Kris tens en et al.Proteomics,2002,2(12):1666~1671.
[44]D Wang,S Liu,B J Trummer et al.Nat.Biotechnol.,2002,20(10):275~281.
[45]T Feiz i,W Chai.Nat.Rev.Mol.Cell.Biol.,2004,5(7):582~588.。