组氨酸修饰聚酰胺-胺型树状高分子提高血清中基因转染效率的研究

在琼脂糖凝胶电泳阻滞实验，复合物粒径测 定，复合物表面电荷测定，ＳＥＭ观察等实验前需要 配制载体／ＤＮＡ复合物。首先，将聚合物溶于适当 体积去离子水配制成所需浓度（由Ｎ／Ｐ决定），然后 向载体溶液加入等体积的一定浓度的ｐＥＧＦＰ—Ｃ１质 粒溶液，涡旋１０ ｓ，室温孵育３０ ｒａｉｎ。作上述检测时 ＤＮＡ的终浓度为２０ ｔＬｅ／ｍＬ。 １．２．４聚合物／ＤＮＡ复合物凝胶阻滞实验
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＰＡＭＡＭ；ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；ｓｅｒｕｍ；ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｅｔｉｏｎ；ｇｅｎｅ ｖｅｃｔｏｒ
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０２５８－８０２１．２０１０．０１．０２１ 收稿日期：２００９—１０－１２。修回日期：２００９—１２．１１
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０８７０６１８）
１（中山大学附属第一医院。心血管研究室，广州５１００８０） ２（中山大学药学院，广州５１００８０）
摘要：组氨酸的咪唑环由于其独特的质子化机理而受到了广泛的关注。研究表明，组氨酸修饰的基因载体可对 抗血清对基因转染的影响，提高载体在血清中的基因转染效率。本研究利用氨解反应将组氨酸接枝到聚酰胺．胺 树枝状高分子（ＰＡＭＡＭ）的表面，制备了一种新型的ＰＡＭＡＭ衍生物一组氨酸修饰的聚酰胺．胺树枝状高分子（Ｈｉｓ． ＰＡＭＡＭ Ｇ４）。利用１Ｈ ＮＭＲ对Ｈｉｓ－ＰＡＭＡＭ Ｇ４进行表征，证明一个ＰＡＭＡＭ Ｇ４分子上接枝３７个组氨酸分子。对 Ｈｉｓ－ＰＡＭＡＭ Ｇ４／ＤＮＡ复合物进行结合ＤＮＡ能力、粒径、表面电位、粒子形态等理化性能的表征，证明该新型聚合物 对ＤＮＡ分子具有良好的压缩能力。细胞活性检测结果表明，Ｈｉｓ－ＰＡＭＡＭ Ｇ４对Ｂｅｌ ７４０２和Ｈｅｌａ细胞的毒性均显 著低于未经修饰的ＰＡＭＡＭ Ｇ４。Ｈｉｓ—ＰＡＭＡＭ Ｇ４在血清中的转染效率与ＰＡＭＡＭ“相比大幅度提高，也显著高于 阳离子聚合物ＰＥＩ ２５ｋ和市售商品阳离子脂质体Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ。因此，Ｈｉｓ－ＰＡＭＡＭ Ｇｄ有望成为一种高效、安全、可 在体内应用的非病毒基因载体。
组氨酸具有咪唑环结构。组氨酸被用于修饰 多种基因载体增强其基因转染效率和在血清中转 染的抗血清能力。有研究证明，在赖氨酸末端组氨 酸化，利用组氨酸咪唑环的质子化能力减少聚合 物／ＤＮＡ复合物通过正电荷进入细胞的途径，从而 使粒子在血清中更稳定，提高该基因载体在血清中 的转染能力¨引。也有研究表明，聚组氨酸／ＤＮＡ复 合物粒子在血清中稳定，不会发生明显的聚集，在 血清中的转然效率较高。因此，利用组氨酸对 ＰＡＭＡＭ Ｇ４进行末端修饰，融合组氨酸和ＰＡＭＡＭ 的优点，有可能改善ＰＡＭＡＭ基因载体在血清中转 然效率较低的缺点，合成出一种适用于体内转染的
关键词：聚酰胺－胺树枝状高分子；组氨酸；血清；基因转染；基因载体
中图分类号Ｒ３１８．０８
文献标识码Ａ
文章编号０２５８．８０２１【２０１０１０１－０１２９－０８
Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＰＡＭＡＭ ａｓ Ｇｅｎｅ Ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ Ｓｅｒｕｍ
以ＰＡＭＡＭ表面的伯胺基对氨酸乙酯盐酸盐的 酯基进行氨解的方法，对ＰＡＭＡＭ表面进行组氨酸 化修饰。１．０ ｇ ＰＡＭＡＭ Ｇ４溶于ｐＨ ７．４的磷酸盐缓 冲液（ＰＢＳ）中，然后加入ＰＡＭＡＭ Ｇ４表面胺基５倍 摩尔量的２一羟基吡啶（２－ＨＰ），搅拌均匀后，再加入 ＰＡＭＡＭ Ｇ４表面胺基５倍摩尔量的组氨酸乙酯盐 酸，在磁力搅拌下４０℃下连续反应４８ ｈ，然后经透 析（截留分子量为１２ ０００）和冷冻干燥得到最终产 品——组氨酸修饰的聚酰胺一胺型树状高分子（Ｈｉｓ－ ＰＡＭＡＭ Ｇ４）。 １．２．２ １Ｈ核磁共振（１Ｈ ＮＭＲ）的测定
２９卷１期 ２０１０年２月
中 国 生 物 医学工 程 学 报 Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖ０１．２９ Ｎｏ．１ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１０
组氨酸修饰聚酰胺－胺型树状高分子提高血清中基因转染效率的研究
温玉婷１
潘仕荣ｈ 郭振寰１ 王 持２ 曾 昕２ 吴红梅２ 冯 敏２
ＷＥＮ Ｙｕ．Ｔｉｎ９１ ＰＡＮ Ｓｈｉ．Ｒｏｎｇ“ ＧＵＯ Ｚｈｅｎ．Ｈｕａｎｌ ＷＡＮＧ Ｃｈｉ２ ＺＥＮＧ Ｘｉｎ２ ＷＵ Ｈｏｎｇ．Ｍｅｉ２ ＦＥＮＧ Ｍｉｎ２
【Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ－Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ。Ｓｕｎ］ｒａｔ－ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１００８０，Ｃｈｉｎａ） ２（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ－Ｓｕｎ Ｙａｔ一，ｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１００８０－Ｃｈｉｎａ）
0105细胞孔的密度将bel7402细胞核hela细胞接种到24孔板上培养2024h待细胞汇合度70转染前吸取细胞培养液每孑l加入500肛l不含血清的1640培养液或含10血清培养液并且每孔加入100tll载体dna复合物溶液含2斗g质粒在无血清条件下培育4h或在含血清条件下培育24h弃去转染复合物加入新鲜含10胎牛血清1640培养液继续培养4048h在荧光显微镜下观察gfp的表达转染率通过流式细胞仪测定
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｕｎｉｑｕｅ ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｉｎ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｔｔｒａｃｔｓ ｗｉｄｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｔｔｅｎｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｃｅｎｔ ｙｅａｒｓ．Ｉｔ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｒｅｐｏｓｅｄ ｂｙ ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｓ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｔｏ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｅｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｂｙ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ｇｅｎｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｉｔｈ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｉｎ ｔｈｉｓ ｗｏｒｋ， ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ ｗａｓ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｏｆ ＰＡＭＡＭ Ｇ４ ｕｓｉｎｇ ａｍｉｎｏｌｙｓｉｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｏ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ａ ＰＡＭＡＭ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ（Ｈｉｓ－ＰＡＭＡＭ Ｇ４）ａｓ ａ ｉｌｅｗ ｇｅｎｅ ｖｅｃｔｏｒ．Ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｉｓ·ＰＡＭＡＭ Ｇ４ ｗａｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｕｓｉｎｇ １ Ｈ ＮＭＲ。ｗｈｉｃｈ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｏｎｅ ＰＡＭＡＭ ｗａｓ ｌｉｎｋｅｄ ｗｉｔｈ ３７ ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ．Ｔｈｅ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｂｉｌｉｔｙ。ｐａｒｔｉｃｌｅ ｓｉｚｅ，ｚｅｔａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ。ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｉｓ—ＰＡＭＡＭ Ｇ４／ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｈｉｓ—ＰＡＭＡＭ Ｇ４ ｃｏｕｌｄ ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｃｏｎｄｅｎｓｅ ＤＮＡ．ＭＴＴ ａｓｓａｙ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｉｓ·ＰＡＭＡＭ Ｇ４ ｗａｓ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｌｏｗｅｒ ｔｈａｎ ＰＡＭＡＭ Ｇ４ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｏ Ｂｅｌ ７４０２ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｈｅｌａ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｉｓ－ＰＡＭＡＭ Ｃ，４ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＧＦＰ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ＰＡＭＡＭ Ｇ４ ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ｓｅｒｕｍ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ。ｔｈｅ Ｈｉｓ．ＰＡＭＡＭ Ｃ，４ ｈｏｌｄｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｎｏｎｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｖｉｖｏ．
利用聚酰胺一胺树枝状高分子ＰＡＭＡＭ Ｇ４表面 的伯胺基氨解组氨酸乙酯盐酸盐的酯基，将组氨酸 接枝在ＰＡＭＡＭ Ｇ４的表面形成Ｈｉｓ—ＰＡＭＡＭ Ｇ４。在 组氨酸乙酯盐酸盐与ＰＡＭＡＭ Ｇ４进行氨解反应过 程中，组氨酸乙酯盐酸盐可发生分子间反应，因此， 反应后需要进行透析（截留分子量为１２ ｏｏｏ）将未反
第七届博士生学术年会“医学工程与生物医药技术”专题优秀论文
·通讯作者。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｚｐｓｈｒ＠１６３．ｃｏｍ
万方数据
中 国生物医学工程学报
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
２９卷
引言
基因治疗（ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ）是指将外源正常基因 或具治疗作用基因以一定方式转入人体靶细胞内 部，通过恢复或增添基因表达以矫正人自身基因功 能和结构的错乱，或抑制外源病原体遗传物质的复 制，从而达到治理疾病的目的¨－３］。将外源性的 ＤＮＡ完整有效地转运进入靶细胞并实现有效的表 达式基因治疗的关键之一。由于具有更好的安全 性，免疫原性低，毒性低，较高的基因包裹能力及成 本低等优点，阳离子聚合物非病毒载体，如多聚赖 氨酸（ＰＬＬ）Ｌ４－ｓ］，聚乙烯亚胺（ＰＥＩ）¨。７ ｏ，聚乙胺，聚 酰胺一胺树状高聚物（ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ ＰＡＭＡＭ）坤１， 壳聚糖（ｅｈｉｔｏｓａｎ）及其衍生物和辐射状树突体等一１， 受到越来越多的关注。然而，阳离子基因载体的转 染效率与病毒载体相比还有一定差距，因此，开发 一种高效、低毒的非病毒载体成为基因治疗的研究 热点之一‘ｍ１¨。
万方数据
１期
温玉婷等：组氨酸修饰聚酰胺一胺型树状高分子提高血清中基因转染效率的研究
１３１
应的反应物和副产物透析除去。 将一定量的ＰＡＭＡＭ Ｇ４、组氨酸乙酯盐酸盐以
及Ｈｉｓ·ＰＡＭＡＭ Ｇ４分别溶解Ｄ：Ｏ中，在核磁共振谱 仪（Ｖａｒｉａｎ ＩＮＯＶＡ５００ＮＢ，美国）上记录１Ｈ ＮＭＲ。 １．２．３ Ｈｉｓ－ＰＡＭＡＭ Ｇ４／ＤＮＡ复合物的配制
聚酰胺。胺树枝状聚合物ＰＡＭＡＭ是正在研究 中的基因载体之一。ＰＡＭＡＭ的末端伯胺基可通过 静电作用连接ＤＮＡ，末端的氨基数目的增加能够增 强对基因的运送释放的能力。有报道称，聚酰胺树 枝聚合物的转染效率高于聚赖氨酸类。ｔ２］。ＰＡＭＡＭ 作为基因载体的一大优势在于它的形状结构一ＤＮＡ 只与表面的伯胺基作用，使得ＰＡＭＡＭ内部的氨基 在溶酶体内可用于中和酸性，增强聚合物的缓冲能 力¨“。还有研究发现，ＰＡＭＡＭ聚合物具有一定柔 韧性，而这种柔韧性对吞噬跑的膨胀破裂至关重 要¨“。尽管ＰＡＭＡＭ在基因转染方面有其独特的 优势，但它也与其他众多阳离子聚合物基因载体一 样，转染效率受血清的影响，因此在体内的转染 较低。
按上述方法制备Ｈｉｓ—ＰＡＭＡＭ Ｇ４／ＤＮＡ复合物， 并且以ＰＡＭＡＭ Ｇ４／ＤＮＡ复合物作为对照。将不同 Ｎ／Ｐ比的复合物溶液（９ ＩｘＬ）与１ ＩｘＬ ９ Ｘ上样缓冲 液混合。电泳条件：０．９％琼脂糖（含０．５ ｔｔｅ／ｍＬ溴 化乙锭），１ ｘ ＴＢＥ缓冲液，电压９０Ｖ，电泳时间为３０ ｒａｉｎ。ＤＮＡ条带用凝胶成像系统分析。 １．２．５动态光散射
基因载体Ｈｉｓ．ＰＡＭＡＭ Ｇ４¨引。 本研究利用ＰＡＭＡＭ Ｇ４表面的伯胺基与组氨
酸乙酯盐酸盐的酯基发生氨解反应，把组氨酸接枝 到ＰＡＭＡＭ Ｇ４的表面，形成新型基因载体Ｈｉｓ－ ＰＡＭＡＭ Ｃ，４。利用１Ｈ ＮＭＲ对所合成聚合物Ｈｉｓ． ＰＡＭＡＭ Ｇ４的结构进行分析；利用琼脂糖凝胶电泳 考察Ｈｉｓ—ＰＡＭＡＭ Ｇ４结合ＤＮＡ的能力；并且利用动 态光散射法测定Ｈｉｓ．ＰＡＭＡＭ Ｇ４／ＤＮＡ复合物的粒 径以及ｇｅｔａ电位；同时运用扫描电镜观察复合物粒 子的形态；利用ＭＴＴ法考察Ｈｉｓ－ＰＡＭＡＭ Ｇ４聚合物 在Ｂｅｌ ７４０２细胞和Ｈｅｌａ细胞中的细胞毒性；利用流 式细胞仪和荧光显微图片考察Ｈｉｓ—ＰＡＭＡＭ Ｇ４的细 胞转染效率，分析其是否在血清中的转染效率与未 经过组氨酸修饰的ＰＡＭＡＭ Ｇ４相比有得到提高。
１ 材料和方法
１．１材料 聚酰胺一胺型树状高分子（ＰＡＭＡＭ Ｇ４）（本实验
室合成）；Ｌ．组氨酸乙酯盐酸盐（上海瀚鸿化工科技 有限公司，中国）；ＲＰＭＩ １６４０培养基，胎牛血清 （Ｇｉｂｃｏ公司，美国）卡那霉素（Ｓｉｇｍａ公司，美国）； 去内毒素核算提取试剂盒（Ｑｉａｇｅｎ公司，德国）；增 强型绿色荧光蛋白表达质粒ｐＥＧＦＰ—Ｃ１（华西医科 大学微生物实验室赠予）。 １．２方法 １．２．１组氨酸修饰聚酰胺．胺型树状高分子（Ｈｉｓ． ＰＡＭＡＭ Ｇ４）的制备