黄芪多糖对气虚小鼠免疫功能的作用研究

黄芪多糖对气虚小鼠免疫功能的作用研究
目的探讨黄芪多糖对气虚小鼠免疫功能的作用。

方法将42只雄性KM 小鼠随机分为3组：黄芪多糖高剂量组（高糖组）、低剂量组（低糖组）、空白对照组，每组14只。

采用力竭游泳法和控制摄食法建立气虚小鼠模型，造模过程中，高糖组、低糖组、空白对照组分别每天2次给予黄芪多糖0.4 mg/10 g、0.2 mg/10 g及蒸馏水0.5 ml/10 g灌胃。

1周后测定小鼠巨噬细胞的吞噬率、胸腺指数、脾指数。

结果高糖组的吞噬率为（96.00±0.19）%，胸腺指数为（1.89±0.16）mg/g，脾指数为（4.83±0.63）mg/g；低糖组的吞噬率为（91.00±0.30）%，胸腺指数为（1.64±0.37）mg/g，脾指数为（4.32±0.77）mg/g；对照组吞噬率为（45.00±0.26）%，胸腺指数为（1.57±0.34）mg/g，脾指数为（4.17±0.43）mg/g。

与空白对照组比较，高糖组与低糖组的巨噬细胞吞噬率、胸腺指数及脾指数显著增高（P＜0.05）。

结论黄芪多糖能增强气虚小鼠吞噬细胞的吞噬能力，促进胸腺和脾脏的恢复，改善气虚小鼠的非特异免疫功能。

标签：黄芪多糖；气虚；免疫功能
黄芪别名绵芪、绵黄芪，为豆科黄芪属植物膜荚黄芪Astragalus membranaceus （Fisch.）Bunge 及蒙古黄芪Astragalus membranaceus var.mongholicus （Bunge）Hsiap [A. mongholicus Bunge] 膜荚的根，具有补气升阳、利水消肿和托疮生肌等功效。

黄芪主要含有黄芪多糖、多种氨基酸、多种黄酮类和苷类、多种微量元素等生物活性物质。

其中多糖的免疫活性很突出[1]，为了进一步研究黄芪多糖（Astragalus polysaccharide，APS）的免疫调节作用，本研究探讨了APS对气虚小鼠巨噬细胞吞噬能力及胸腺、脾的影响。

1 材料与方法
1.1 药品
黄芪药材，购于广州市药材公司中药饮片厂，批号：YIA1A0001，经鉴定为黄芪。

1.2 主要仪器和试剂
TGL-16高速台式冷冻离心机，广州讯成科学仪器开发有限公司；LD5-2A 低速离心机，北京医用离心机厂；分析天平，广州湘仪机电设备有限公司；JJ500型电子天平，常熟市双杰测试仪器厂；WFJ720型可见光光度计，上海尤尼柯仪器有限公司；SMART生物显微镜，重庆奥特光学仪器有限公司。

X-5树脂，安徽三星树脂科技有限公司生产；95%乙醇，三氯乙酸，6%苯酚，硫酸（分析纯），乙醚，丙酮；淀粉肉汤液：将肉汤培养基3 g加于100 ml蒸馏水煮沸溶解，再加入可溶性淀粉1 g，煮沸溶解，待冷却后加入1滴台盼蓝，混匀后煮沸灭菌，置4℃保存，使用时温浴溶解；2%鸡红细胞悬液：实验前临时取
鸡血用肝素钠抗凝，离心弃去上清液，用生理盐水洗涤3次后得鸡血红细胞，取1 ml加到50 ml生理盐水即可。

1.3 实验动物
健康KM成年小鼠，SPF级，体重20～50 g，由广州中医药大学实验动物中心提供。

实验动物质量合格证号：SCXK（粤）2008-0002，合格证号：0070152。

实验动物中心SPF实验室条件严格控制，温度20～25℃，日温度差≤3℃。

湿度为40%～50%，空气清洁度10 000级，14 h黑暗，人工光照照明（上午8：00～下午6：00）。

饲养期给予SPF鼠饲料，添加足量饲料，引用蒸馏水。

1.4 方法
1.4.1 多糖试剂的制备
1.4.1.1 APS分离纯化以黄芪质量10倍水量煎煮，煎煮3次，合并煎煮液，上X-5树脂柱，收集流出液并浓缩，加95%乙醇至使乙醇占总重量的70%，离心后弃去上清液，沉淀用蒸馏水溶解，加液体体积4%三氯乙酸，离心后取上清液，再次加95%乙醇至使乙醇占总重量的70%，离心后取沉淀，按照95%乙醇→丙酮→乙醚的顺序洗涤得粗多糖。

1.4.1.2 多糖含量测定采用苯酚-硫酸法。

葡萄糖标准溶液的配制：精密称取充分干燥至恒重10 mg葡萄糖标准品，加去离子水溶解，配制100 ml标准溶液，标准溶液浓度为0.1 g/L，分别吸取配制好的葡萄糖标准溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 ml于10 ml容量瓶中，分别加去离子水至2 ml，加入5%苯酚溶液1 ml，摇匀后迅速加入5 ml浓硫酸显色，振荡5 min，在沸水浴上加热15 min，取出后于冷水浴中冷却30 min，以空白为参照，用紫外分光光度计在490 nm处测吸光度（A）（表1），标准曲线：A=21.371C+0.1366，R2=0.9943，表明葡萄糖浓度（C）在0.005～0.0225 mg/ml线性关系良好。

称取粗多糖产品0.10 g，配制成浓度为1 mg/ml的样品溶液，准确移取5 ml 样品溶液稀释到0.1 mg/ml，取2 ml稀释后的样品溶液加入5%苯酚溶液1 ml，摇匀后迅速加入5 ml浓硫酸显色，振荡5 min，在沸水浴上加热15 min，取出后于冷水浴中冷却30 min，按照苯酚-硫酸法于490 nm处测定其A值，代入线性回归方程计算浓度，计算出粗多糖中的糖百分含量为41%，其中A=0.346。

1.4.1.3 APS试剂配制将粗多糖溶解成0.8、0.4 mg/ml水溶液，作为高糖溶液和低糖溶液。

1.4.2 分组、造模与给药
将小鼠完全随机分为APS高剂量组（高糖组）、低剂量组（低糖组）、空白对照组，每组14只。

参考文献[2]的方法，采用力竭游泳和控制摄食法建立气虚小鼠模型。

小鼠置于水深50 cm的玻璃箱水池中，水温（37±1）℃，要求小鼠沉
入水底，经10 s后仍不能返回水面为力竭标准。

每天均游泳至力竭并隔日喂食。

其中高糖组每天2次按0.4 mg/10 g剂量灌服高糖溶液；低糖组每天2次按0.2 mg/10 g剂量灌服低糖溶液；对照组每天2次灌服蒸馏水0.5 ml/10 g，持续1周。

1.4.3 指标测定
1.4.3.1 巨噬细胞吞噬能力实验的第5天腹腔注射1 ml淀粉肉汤液，以刺激小鼠的腹腔产生较多的巨噬细胞。

到第7天往其腹腔注射2%鸡红细胞悬液1 ml，然后轻揉小鼠腹部使鸡细胞分散。

30 min后通过颈椎脱臼处死实验小鼠，并向腹腔注射0.5 ml生理盐水，轻揉小鼠腹部，使其腹腔液稀释。

用吸管吸取腹腔液，制临时装片并通过显微镜观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力[3]。

吞噬率=有吞噬鸡红细胞的巨噬细胞个数/巨噬细胞的总个数，平均吞噬个数=已吞噬的鸡红细胞总量/巨噬细胞的总个数。

1.4.3.2 胸腺指数及脾指数颈椎脱臼处死小鼠后，摘取脾脏及胸腺并称重。

参照文献[4]，以脾脏重量（mg）、胸腺重量（mg）分别与小鼠体重（g）的比值为脾指数和胸腺指数。

1.5 统计学处理
运用统计软件SPSS 13.0进行统计分析，计数资料以均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 3组巨噬细胞吞噬能力的比较
与空白对照组比较，高糖组与低糖组的吞噬率及平均吞噬个数显著增高（P ＜0.05）。

高糖组吞噬率>低糖组吞噬率>对照组吞噬率，高糖组平均吞噬个数>低糖组平均吞噬个数>对照组平均吞噬个数，表明APS可增强小鼠巨噬细胞的吞噬能力（表2、图1）。

2.2 3组胸腺指数及脾指数的比较
与空白对照组比较，高糖组与低糖组的胸腺指数及脾指数显著增高（P＜0.05）。

高多糖组胸腺指数>低糖组胸腺指数>对照组胸腺指数，高多糖组脾指数>低糖组脾指数>对照组脾指数（表3）。

3 讨论
气虚证是临床上常见的证候，常有少气懒言、语言低微、倦怠无力、食少便溏、自汗等临床表现。

“虚者补之”，气虚则补气。

黄芪味甘性微温，具有补气升阳、固表、利水消肿等功效，临床多用于气虚自汗、脾、肺气虚等证。

文献表明黄芪具有较广泛的药理作用，有实验发现，正常大鼠饲以含黄芪粉末的食物1周后，测其耗氧量比服药前逐渐增加，能加强正常心脏收缩，对哀竭的心脏有强
心作用，能使冠状血管和肾脏血管扩张，并使全身末梢血管扩张，皮肤血液循环畅顺，使高血压患者血压下降。

利尿试验证明黄芪有中等的利尿作用。

实验证明黄芪对防止和治疗大鼠实验性胃溃疡有一定的作用[5]。

中药多糖具有增强单核吞噬细胞系统、激活补体系统的作用，从而调节机体免疫功能[6-12]。

APS是黄芪的主要有效成分，有提高机体免疫力的作用；对垂体后叶素引起的心肌缺血有保护作用，并明显对抗BaCl2诱发的大鼠心律失常和CHCl2诱发的小鼠室颤；还有双向调节血糖的作用，可使葡萄糖负荷后的血糖水平显著下降；对60Co照射后小鼠损伤的脾脏组织有明显的恢复作用。

气虚证动物模型主要根据导致气虚的因素建立。

中医理论认为气虚证是由久病、气耗、年事衰老、饮食失调等所致[2]，目前气虚模型建立的方法主要用寒冷刺激、强迫运动、减少食量、大黄泄泻等方法制成。

力竭运动导致疲劳，属中医的“劳倦”范畴，所谓“劳者气耗”（《素问·举痛论》），“力竭游泳”刺激因素符合导致气虚的病机，而且这种造模方法比较简单，具有可控性强和重复稳定的特点。

同样，在运动医学临床实践中，发现运动员的运动性疲劳与中医气虚证一致。

有研究显示，运动员在运动疲劳前后脉图的变化情况，发现运动员疲劳后表现出的脉图与中医气虚证脉象较为一致[13]。

本研究结果显示，通过力竭游泳并隔日喂食到一定程度后，经过一定时间后就出现中医气虚证的症状。

经解剖部分脏器萎缩，就本次实验观察的胸腺，脾质量均比正常小鼠略轻，而胸腺是机体的免疫中枢器官，担负着T淋巴细胞的发育、成熟、分化等作用，与机体免疫功能密切相关。

实验发现胸腺、脾指数降低和巨噬细胞吞噬能力下降，表明气虚小鼠存在免疫功能下降。

APS对上述指标有显著改善作用，表明APS具有改善机体免疫功能的作用。

[参考文献]
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