DNA限制性内切酶 分生讨论

3.
4. 5. 6. 7.
同上
同上 反应前离心数秒
将内切酶稀释，增大取样体积
电泳前将样品臵65℃保温5-10 分钟，取出后臵冰浴骤冷 使用标准反应缓冲液及温度， 避免强烈振荡 适当稀释酶液，反应液稀释的 酶不能贮藏 使用最佳反应体系 加大酶量5-10倍
对 策
8.
9.
10. 11.
三、如果DNA片段数目多于理论值？
原因
1. 2. 3.
内切酶星状活性 其它内切酶污染 底物中含其它DNA杂质
1.
对 策
检查反应条件：甘油浓度大于12% ，盐度过低，Mn2+的存在及酶： DNA值过大均均可导致星状活性 ，降低酶的用量
2.
3.
用λDNA作底物检查酶切结果
电泳检查DNA，换用其它酶切， 纯化DNA片段
DNA的限制性酶切原理、步骤、影响因素 和酶切结果分析
主讲：叶晨 陈炳宏（麻醉1201）
限制性核酸内切酶发现
每当我走进父亲的办公室，总会看见他桌上放着的一 些培养皿，里面装的是菌群。它们就象一个住着许多居民 的城市，在每一种细菌中都有一个国王，他长得瘦瘦的、 高高的。国王有很多仆人，这些仆人长得矮矮胖胖的，跟 皮球差不多。父亲把国王叫做“DNA”，仆人叫做“酶”。 国王就像一本书，仆人们做的每一件事情在这本书中都有 记载。对于我们人类来说，国王记载的这些细目是个谜。 我爸爸已经发现了其中的一个仆人，他的工作就像一 把剪刀，如果有外国国王来侵犯一个细菌，这个仆人就会 把他剪成小碎片，但他不会对自己的国王造成任何伤害。 聪明的人类用这个带着剪刀的仆人来探究国王的秘密， 他们搜集了很多带剪刀的仆人，并把他们放进一个国王里， 这个国王就被剪成了碎片。用这种方法得到的小碎片使人 类探究国王的秘密变得容易了。爸爸就是因为发现了带着 剪刀的仆人而获得了诺贝尔奖。
二、限制性内切酶酶切反应
1.
① DNA：必须具备一定纯度，微量的酚、氯仿、大 于10mM的EDTA、去垢剂、及高盐的存在均将 影响限制性内切酶的活性。DNA碱基上的甲基化 修饰也是影响酶切的重要因素。 ② 反应缓冲液：不同厂家、不同的酶都有不同的最 佳反应条件。应严格按照产品说明书操作。双酶 切时要选择两种酶都具有最高活性的缓冲液。 ③ 反应容积：在DNA浓度<0.4μg/μl的情况下，根 据后续实验的要求选择合适的反应容积。过高浓 度的DNA会使溶液过于粘稠影响酶的扩散，并降 低酶活性。
从电泳结果可以看出，第三泳道出现两个区 带，第二泳道只有一个比较宽大的区带，也就是 说，限制性核酸内切酶将质粒切割成了性质不同 的两部分，说明了限制性核酸内切酶对DNA的 切割活性。
六、分析讨论
一、如果DNA完全没有被内切酶切割？
原因
1. 2.
1.
标准底物检测酶活性
2.
将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA
DNA限制性内切酶
原 理
酶 切 反 应
实 验 步 骤
影 响 因 素
结 果 分 析
讨 论
一、实验原理
• 核酸限制性内切酶（restriction enzyme）是一类能识别双链 DNA特定碱基序列的核酸水解酶。能识别双链DNA分子内部的特 异位点并裂解磷酸二酯键。 • 特异位点：特定的碱基序列，通常是4~6个碱基对、具有回文序 列的DNA片段，大多数酶是错位切割双链DNA分子，产生5ˊ或 3ˊ粘性末端。 • 磷酸二酯键：一种化学基团，指一分子磷酸与两个醇（羟基）酯 化形成的两个酯键。该酯键成了两个醇之间的桥梁。例如一个核 苷的3ˊ羟基与另一个核苷的5ˊ羟基与同一分子磷酸酯化，就形 成了一个磷酸二酯键。
２．ＤＮＡ： 作为内切酶底物，ＤＮＡ应该具备一定的纯度，其溶液中不 能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这 些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。 这种抑制可通过： ★增加酶作用单位数（10~20U/ug DNA）、 ★增大反应体积以稀释可能的抑制剂 ★或延长反应时间加以克服。
基因工程中使用的DNA限制性内切酶
• II型酶限制修饰系统分别由限制酶和修饰酶组成。II 型限制酶需要Mg2+作为催化反应辅助因子，能识别双 链DNA的特定序列，一般为4-6个碱基的反转重复序 列。II型限制酶一般在识别序列内进行切割，产生特 异的DNA片断。 • II型修饰酶识别和II型限制酶一致的DNA序列，但其 作用是负责对识别序列的甲基化修饰。
• II型限制酶切割DNA双链可产生三种不同的DNA末 端：平末端、5’端突出的粘性末端、和3’端突出的 粘性末端。
BamH I识别及切割位点： 5’…G↓GATC C…3’ 3’…C CTAG↑G…5’ ↓ 5’…G3’ 5’GATCC…3’ 3’…CCTAG5’ 3’G…5’ Xho I识别及切割位点：5’…C↓TCGA G…3’ – 3’…G AGCT↑C…5’

４．酶解温度与时间：
大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应， 反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则 是酶：ＤＮＡ=２－３：１ 1~2小时即可充分酶解。

五、酶切结果
1
2
3
1泳道 maker
2泳道 质粒DNA 3泳道 酶切产物

３．反应缓冲液：
反应缓冲液主要由Tris· HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+ 为内切酶辅基； Tris· HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间； NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度： 低盐（10mM NaCl) 中盐（50mM NaCl） 高盐（100mM NaCl） 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
配制反应体系
Байду номын сангаас
④ 内切酶及使用的酶量
• • 根据实验要求选择限制性内切酶。 1个酶活力单位的定义：在50μl反应体系中， 1μgDNA在推荐的反应缓冲液和温度下反应1 个小时，被完全酶切所需要的内切酶的量。 过量的酶可缩短反应时间。但使用过多的酶将 导致识别序列特异性下降。一般采用2-10倍的 酶量。 加入酶的总容积不能超过反应体系总容积的 10%。否则甘油终浓度将达到5%以上，将抑 制酶的活性。
–
3. 终止反应：可以通过以下3种方式终止酶切 反应：
① 若DNA在酶切后不进行进一步的酶反应时，可加 入EDTA至终浓度10mM，或加入0.1%SDS。 EDTA对酶的灭活彻底，但EDTA存在将使连接 反应变得极为困难。 ② 若DNA在酶切后须进行下一步的酶反应，可将反 应产物置65℃或80℃加热20分钟。但有些酶加 热灭活不彻底。 ③ 用酚/氯仿抽提，然后乙醇沉淀。
分类
• 限制性核酸内切酶都是在原核生物中发现的，可以为宿主抵 御外来DNA的侵袭。根据酶的切割特性、催化条件及是否具 有修饰性可分为I、II、III型三大类。 • I型酶具有核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶四种 活性。其内切酶的识别位点和切割部位不一致，相距几千个 碱基，无固定的切割位点，不产生特异片断。 • III型酶和I型酶类似，也有甲基化功能，但无ATP酶和DNA 解旋酶活性。此类酶可在DNA链的特异位点切割，但切割位 点在识别位点之外，一般相距几十个碱基，对基因工程的意 义也不大。
0.5μl
2. 混匀试剂。将离心管置37℃水浴，反应1小 时。
• 微量移液枪
• 将微量离心管置于适当支撑物上面（如插在泡沫塑 料板上面）
3. 琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段
① 制备1%琼脂糖凝胶。 ② 在每个酶切反应管中加入1/10体积10X上样缓 冲液，混匀。 ③ 将样品平均加入2个加样孔内，每个孔加样 27.5μl。 ④ 135V衡压电泳30-40分钟。 ⑤ 在紫外灯下观察酶切条带。 ⑥ 将酶切完全的质粒大片断、PCR产物从凝胶中 切割下来，装入1.5ml微量离心管中。 ⑦ 置-20℃保存。
3. 4.
3. 4.
5.
5.
对 策
6.
6. 7.
DNA不存在该酶识别顺序
7.
换用其它的酶切割DNA或过量酶 消化进行验证
二、如果DNA切割不完全？
1. 2.
原因
1.
2. 3. 4. 5. 6. 7.
用5-10倍量过量消化 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释 酶
8.
9. 10.
11.
内切酶活性下降 内切酶稀释不正确 DNA不纯，反应条件不佳 内切酶识别的DNA位点上的碱 基被甲基化或存在其它修饰 部分DNA溶液粘在管壁上 内切酶溶液粘度大，取样不准 酶切后DNA粘末端退火 由于反应溶液、温度、强烈振 荡使内切酶变性 过度稀释使酶活性降低 反应条件不适 识别位点两侧插入了可影响酶 切效率的核酸顺序
•
•
2. 酶切温度及时间：根据产品说明确定最佳反应 温度。反应时间不宜太长，以免内切酶产生星 活性。
– 星活性（Star Activity）：是指限制性内切酶在 某些反应条件产生的识别并切割非特异序列位点的 现象。其结果是酶切条带增多。 星活性除了与酶本身的性质有关外，与酶过量、甘 油浓度过高，pH值不合适、离子浓度过低、酶切 时间过长等有关。酶切时间比增加酶量更易产生星 活性。
4. 酶切结果的鉴定 酶切完成后，取适量反应液进行琼脂糖凝胶 电泳观察酶切结果。
三、实验步骤
1. 按顺序，在1.5ml微量离心管中配制反应试剂：
① ② ③ ④ 10X Buffer（缓冲液） DNA (~100ng/μl)（质粒） BamH I (15Units/μl) Xho I (10Units/μl) 5μl 44μl 0.5μl
检查反应系统是否最佳 换用对DNA甲基化不敏感的同裂 酶酶解，重新将质粒DNA转化至 dcm-，dam-基因型的细菌菌株 换用不同切割非甲基化位点的同裂 酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌 株中扩增 将DNA底物与λDAN混匀进行切 割验证
内切酶失活 DNA不纯，含有SDS，酚 ，EDTA等内切酶抑制因子 条件不适（试剂、温度） DNA酶切位点上的碱基被 甲基化 DNA酶切位点上没有甲基 化（如Dpn I） DNA位点上存在其它修饰
这是瑞士微生物遗传学家W· 阿尔伯（1929－）的女儿 西尔维娅（当时10岁）在听完父亲给她讲完限制性内切酶 后写下的一个故事，限制性内切酶就是故事中带剪刀的仆 人。 限制性内切酶能够在DNA上寻找特定的“切点”，认 准后将DNA分子的双链交错地切断。因此，限制性内切酶 被称为“分子剪刀”，它可以完整地切下个别基因。 1965年，阿尔伯首次从理论上提出了生物体内存在具 有切割基因功能的限制性内切酶。并于1968年成功分离出I 型限制性内切酶，但这种酶的切割基因功能不理想。1970 年，美国分子生物学家、遗传学家H· 史密斯（1931～） O· 分离出了II型限制性内切酶。1971年，美国微生物遗传学 家D· 内森斯（1928～）使用II型限制性内切酶首次完成了 对基因的切割。他们的研究成果为人类在分子水平上实现 人工基因重组提供了有效的技术手段，他们于1978年获得 诺贝尔生理学或医学奖。
四、影响因素
１．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的 污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定， 通常 1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定 ＤＮＡ底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般 以１ug DNA对２－３u酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切 酶中含５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内 切酶活力； 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止 操作中对内切酶的污染。