巯基乙醇对玉米中氨基酸测定的影响(最终版)

学士学位毕业论文
巯基乙醇对玉米中氨基酸
测定的影响
学生姓名：焦佳宁
学号：20084031210
指导教师：姜宁
所在学院：动物科技学院
专业：动物科学
中国·大庆
2011年5月
巯基乙醇对玉米中氨基酸测定的影响
摘要：近些年由于各种有毒添加剂造成的有毒饲料引起的事件层出不穷，造成了人们对食品安全的恐慌。

而饲料中的氨基酸对动物的生长发育中重要的影响，因此对饲料中氨基酸的检测分析时势所趋且具有重要意义。

本论文探讨水解的时间不同且添加巯基乙醇后对饲料中氨基酸测定的影响。

采用酸水解法对加入巯基乙醇及对照样品进行水解得到水解液，再利用高效液相色谱仪运用2、4-二硝基氯苯对水解液柱前衍生进行测定。

关键词：氨基酸；巯基乙醇；酸水解法；高效液相色谱仪；2、4-二硝基氯苯
Mercaptoethanol the determination of amino acids in corn
Abstract: In recent years, caused by a variety of toxic additives toxic feed event after another, resulting in the panic of the people on food safety. Important influence on the growth and development of the amino acids in the feed of animals, the detection of amino acids in the feed to the trend of the times and of great significance. This paper examines the hydrolysis and the determination of amino acids in the feed after adding mercaptoethanol. The acid hydrolysis hydrolysis hydrolyzate, join mercaptoethanol and control samples using high performance liquid chromatography using 2,4 - dinitrochlorobenzene derivatives were measured before on the hydrolysis of the liquid column.
Key words: amino acids,mercaptoethanol, acid hydrolysis, high performance liquid chromatography,2,4 - dinitrochlorobenzene
目录
前言 (1)
1 材料与方法 (2)
1.1 试剂 (2)
1.2 仪器 (3)
1.3 色谱条件 (3)
1.4 样品水解 (4)
1.5 氨基酸的衍生化反应 (4)
1.6 工作曲线 (4)
1.7 样品氨基酸含量计算公式 (5)
2 结果 (5)
2.1 玉米粉氨基酸图谱 (5)
2.2 各图表面积关系 (6)
3 讨论 (6)
4 结论 (7)
参考文献 (8)
致谢 (9)
附录 (10)
前言
氨基酸是蛋白质的基本结构单位和生物代谢过程中的重要物质，其分子结构中既含有氨基(-NH2)，又含有羧基6COOH)。

组成蛋白质的氨基酸有20余种，除甘氨酸以外，氨基酸分子都有不对称碳原子，因而具有光学活性，即有I型和D型异构体。

氨基酸广泛应用于食品、医药、添加剂及化妆品行业[1]。

目前，氨基酸的分析方法很多，主要有高效液相色谱法（HPLC）[2]、氨基酸分析仪法[3]、毛细管电泳法[4]、质谱法(包括气相色谱．质谱法和液相色谱．质谱法)[5-6]等。

氨基酸分析仪法是最重要的氨基酸分析方法，它具有操作简便，无需单独进行柱前衍生等优点，但是因为需要一套专门的设备和试剂，仪器本身价格昂贵，测试程序耗时比较长，因此成本较高。

相较于其它方法而言，高效液相色谱法(HPLC)无需特殊反应装置，具有高效、简便、快速、准确和价格低廉等优点，已成为一种较为理想的检钡4氨基酸的方法。

用高效液相色谱法(HPLC)测定氨基酸，要求对氨基酸进行衍生。

衍生是将氨基酸衍生为有利于分离和检测的化合物。

因为大多数氨基酸不含有芳香环等紫外或可见光吸收基团，无法直接用紫外、可见光吸收法检测，也无荧光发色基团，也不能用荧光法检测，所以需要先将氨基酸衍生为具有较强紫外或荧光吸收的衍生物。

衍生又分为柱前衍生和柱后衍生。

柱后衍生所需附加装置价格昂贵，分析时间长，现今采用柱前衍生HPLC，则简便、快捷等优点，唯一制约的条件是，选择的机器条件不同，需要摸索各操作程序与执行条件。

目前常用衍生剂有邻苯二甲醛(OPA)[7]、异硫氰酸苯酯(PITC)[8]、2，4-二硝基氟苯(DNFB)[9]、丹酰氯[10]等。

而两种新型衍生剂6-氨基喹啉基-N-羟基-琥珀酰亚胺基甲酸酯(AQC)[11]和2，4-二硝基氯苯(CDNB)[12]的应用也已见报道。

AQC具有灵敏度高、衍生迅速、衍生物稳定等特点，但是其成本较高，每测定一个样品的试剂成本约100元人民币。

故本实验采用了CDNB作为衍生剂，CDNB具有价廉易得，理化性质稳定，衍生化过程简便，衍生产物稳定，过量的CDNB对测定无干扰等优点制得17只能够DNP-氨基酸，再利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行分析检测。

1 材料与方法
1.1 试剂
1.1.1 标准氨基酸溶液：
分别取天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、丝氨酸（Ser）、甘氨酸(Gly)、组氨酸（His）、苏氨酸（Thr）、赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、酪氨酸（Tyr）、甲硫氨酸（Met）、缬氨酸（Val）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、胱氨酸（Cys）等18种氨基酸0.0100g，用0.10mol/m L的盐酸定容至10.00m L，配制成1.00mg/m L的标准贮备液，放置于-20℃冰箱中保存。

如下表：
表 1 混合标准氨基酸储备液配制
该氨基酸混合标准储备液中总氨基酸浓度为1.69×103ug/m L。

临用前，取该标准储备液 5.92m L，用纯净水定容至10.00m L,配制成总氨基酸浓度为1.00×103 ug/m L的氨基酸混合标准应用液。

再分别取5.00m L、2.00m L、1.00m L，1.00ug/m L的氨基酸混合标准应用液用纯进水定容至10.00 m L，配制成500ug/ m L、200ug/ m L、300ug/ m L的标准应用液。

1.1.2 内标4-氨基丁酸储备液的配制：
称取0.53g的无水碳酸钠，用纯净水定容至10.00mL。

1.1.3 0.5mol/mL碳酸氢钠溶液：
称取0.42g的碳酸氢钠，用纯净水定容至10.00m L。

1.1.4 0.50mol/mL碳酸氢钠缓冲液（PH9.0）：
取10.00m L0.50mol/m L碳酸钠溶液用0.05mol/m L碳酸氢钠溶液调pH9.0。

使用前加0.15%三乙胺，混匀。

1.1.5 30mg/mL2,4-二硝基氯苯：
称取2,4-二硝基氯苯0.30g，用乙腈溶液定容至10.00m L。

1.1.6 10%乙酸溶液：
取乙酸（色谱纯）10m L于烧杯中，用纯净水定容至100m L.
1.1.7 流动相A
50%乙腈：经过多次实验得到流动相A乙腈浓度为50%，且先加水后加乙腈，取250ml超纯水于烧杯中，再加入250m L乙腈（色谱纯），用超声震荡仪震荡排气，临用现配。

1.1.8 流动相B
PH=5.2乙酸-乙酸钠缓冲液：称取 1.25g乙酸钠，用水溶解后定容至500m L，加入0.75ml三乙胺，混匀，冰乙酸调节pH至5.20,用前使用超声震荡仪震荡排气。

1.2 仪器
1.2.1 XT-9900智能微波消解仪：上海新拓溶样测试技术有限公司
1.2.2 Water高效液相色谱仪：Sunfire C18,4.6nm*150nm,5nm
1.2.3 梅特勒-托利多DELTA-320-PH计:梅特勒托利多（上海）有限公司
1.2.4 电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司
1.2.5 电子分析天平（感量0.0001g）：上海安亭科学仪器厂
1.2.6 微量移液器：上海大龙仪器有限公司
1.2.7 冰箱
1.2.8 离心机：上海安亭科学仪器厂
1.2.9 超声波震荡仪
1.3色谱条件
1.3.1 色谱柱：C18柱，5μm，150×4.6mm；
1.3.2 柱温：28℃；
1.3.3 流动相A:50%乙腈，
1.3.4 流动相B：乙酸-乙酸钠（pH5.20）缓冲液；
1.3.5 流速：1.0m L/min；
1.3.6 检测器：2487检测器波长360nm；
1.3.7 进样：20μL定量环进样；
1.3.8 线性梯度洗脱：梯度见下表；
1.3.9 运行时间：45min。

图1 混合标准氨基酸图谱
1．天冬氨酸(Asp，1.498min)2．谷氨酸(Glu,2.271min) 3．组氨酸(His，3.131min)4．丝氨酸(Set,3.381min)5．精氨酸(Arg，3.698min) 6．甘氨酸(Gly,4.823min)7．苏氨酸(Thr,5.320min) 8．脯氨酸(Pro,5.591min) 9．衍生剂水解产物（CDNB-OH，6.423min）10.丙氨酸(Ala，9.579min)11．内标(GABA，10.011min)12．缬氨酸(Val，10.193min) 13．甲硫氨酸(Met，
11.840min)17．色氨酸(Trp,12.192min)18．苯丙氨酸(Phe，12.760min)19．赖氨酸CLys,15.458min)20．酪氨酸(Tyr, 18.307min)
所求的回归方程结果如表2。

表2 氨基酸标样的回归方程
1.7 样品氨基酸含量计算公式
按下式计算上机样品中氨基酸的浓度。

C=a×(1.00/0.080)×(1/0.02)×10-3
式中:C为样品中氨基酸的浓度(μg/ml)，a为从工作曲线查得或由回归方程求得的氨基酸含量(ng)，0.080为用于衍生的样品体积(ml)，1.00为最后定容体积(ml)，0.02为进样体积(ml)
2 结果
2.1 玉米粉氨基酸图谱
图 2含巯基乙醇水解玉米粉氨基酸图谱
1．天冬氨酸(Asp，1.607min)2．谷氨酸(Glu,4.5791min) 3．组氨酸(His，7.867min)4．丝氨酸(Set,8.5871min)5．精氨酸(Arg，9.431min) 6．衍生剂水解产物（CDNB-OH，9.090min）7．甘氨酸(Gly,10.515min) 8．苏氨酸(Thr,10.691min) 9．脯氨酸(Pro,10.9731min) 10.丙氨酸(Ala，11.483min)11．内标(GABA，12.566min)12．缬氨酸(Val，12.795min) 13．甲硫氨酸(Met，
16.733min)17．色氨酸(Trp,17.170min)18．苯丙氨酸(Phe，21.077min)19．赖氨酸CLys,25.756min)20．酪氨酸(Tyr,27.367min)
本实验中巯基处理玉米氨基酸结果见图2，其中多数氨基酸分离被检测出，而个别氨基酸，如苯丙氨酸、赖氨酸和酪氨酸没有出峰。

2.2 各图表面积关系
表3 两种处理样品水解面积关系
经过试验可以得出，水解时加入巯基乙醇氨基酸分离效果比没加入巯基乙醇的样品更加明显，由于巯基乙醇这种还原剂可以更好的保护一些氨基酸在水过程中不流失，没有加入巯基乙醇的样品中的氨基酸都混入衍生峰中没有分离出来，且本试验还借鉴了赵剑虹的试验方法[13]，在缓冲剂中加入了0.15%的三乙胺防止出现拖尾现象，这一方法在这次实验中也得到了验证。

在这次试验中经过老师指导减少了衍生剂的加入量，降低了衍生剂水解产物对氨基酸分离的干扰。

表4 玉米中氨基酸浓度表
综上所述，水解时加入巯基乙醇可以保护氨基酸在水解过程中被氧化的程度较低，从而利于氨基酸的分离。

3讨论
本试验参考了赵剑虹的试验方法[13]，根据本试验的实验目的及现有实验条件，对其试验方法作了部分调整。

赵剑虹方法中的色谱条件，2，4-二硝基氯苯衍生样品的方法，加入三乙胺防止拖尾现象发生的方法，经过作者多次试验的验证，对于测定氨基酸效果理想。

本试验中所用的色谱条件，衍生方法，防拖尾方法，经本次试验验证，成功得出试验结果，说明以上方法同样适用于饲料中氨基酸的检测分析。

本实验采用了2,4-二硝基氯苯为衍生剂，它有与2，4一二硝基氟苯(DNFB)一样的二硝基苯基团，可以与氨基进行衍生化反应生成具有紫外吸收的物质。

但与FDNB法相比，具有衍生试剂价廉易得、理化性质稳定、制各试样方便单等特点。

国内目前应用2，4-二硝基氟苯法测定样品中氨基酸的报道较多，应用2，4-二硝基氯苯法测定样品中氨基酸的报道较少，仅见李芳，史霄燕[12]，赵剑虹[13]等人对此种方法的试验研究，并取得理想效果。

在赵剑虹的实验方法中未提及饲料样品处理方法，本试验参考了张丽英[14]书中的理论，并经过试验验证，采用了酸水解法处理样品成功得到氨基酸水解液。

在水解前加入巯基乙醇更是保护了一些氨基酸在水解过程中的流失。

使氨基酸分离明显，实验结果更加精确。

经过姜宁老师的指导与总结学长们实验的经验，本次试验衍生剂添加量减少到80μL，这样可以更好的分离氨基酸，避免了衍生剂水解产物过多干扰氨基酸分离的现象。

同样本次试验采用了50%的乙腈作为流动相A，比用纯乙腈氨基酸分离效果更好。

4 结论
经过反复试验对比得出，水解时加入巯基乙醇氨基酸分离效果比较明显。

是由于巯基乙醇这种还原剂的加入，在水解过程中保护了一些易流失的氨基酸，如色氨酸、组氨酸等。

且加入80μL衍生剂减少了衍生剂水解产物对氨基酸分离的干扰。

缓冲剂中加入三乙胺，使氨基酸分离中防拖尾，氨基酸分离效果更明显。

参考文献
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[13]赵剑虹.柱前衍生-高效液相色谱法测定大熊猫血清中18种氨基酸[J].分析试验室，
2007，26(11):15~19.
[14]张丽英.饲料分析及饲料质量检测技术[M].第3版，北京:中国农业大学出版社出版
社，2007，106～131.
致谢
两年大学的学习和生活就要随着这篇论文的答辩而结束了。

首先衷心感谢的是我的指导老师姜宁老师！在您帮助下我很快的融入我们的实验室，并为我在试验中指点迷津，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。

您对我学习和研究的悉心指导和谆谆教诲令我终身受益。

在您的指导下，我在各方面的能力都得到了相应的提高。

您一丝不苟的作风，严谨求实的态度，踏踏实实的精神，不仅授我以文，而且教我做人，您的睿智、对知识孜孜不倦的追求、对教育科学研究的热爱、严谨的治学态度让我学到了如何做事，千言万语在此刻化为了一句谢谢您。

感谢我的班主任张旭老师，您在这两年对我的关心、帮助及指导，让我少走了很多弯路，不管生活还是学习中我都有了很快的成长，学会了坚强面对，勇敢选择做自己。

也感谢您能够信任我，做为班级的团支书，我在各方面得到了锻炼，也收获了许，老师信任，同学的友谊。

是每位老师的悉心教导使我完成这篇论文的基础，你们教授的知识我会牢记并予以应用，现在我已不再是那个刚入大学校门的学生了，四年的磨砺让我的肩头多了一份责任和承担，即将踏入社会开始工作的我，面临的抉择和困难也非常之多，但是不管前途多么的未知和艰难，我会毫无畏惧地前行。

感谢我认识实验室的师兄们，除了姜老师的指导你们对我的帮助也是非常大的，你们是我完成课题及论文的关键，感谢的话无以言表；感谢大学期间一直陪我的室友和我的同学们，是你们在我无助的时候给予我帮助，是你们陪我度过大学每一天，谢谢你们。

最后要感谢的是我的父母和家人，我永远都不会忘记你们的良苦用心和一如既往的支持与鼓励。

两年来，快乐的事情因为有你们的分享而更快乐，失意的日子因为有你们的关怀能忘却伤痛，坚强前行。

无论我成功与否，你们总以鼓励的言语告诉我很棒，谢谢你们，我会继续努力。

不辜负所有人对我的期望。

附录
The pre-column UV
derivatives-highperformanceliquidchromatography method for simultaneous determination of serum and 18 kinds of amino acids
in beverages
Zhaojianhong
Abstract
Objective: To establish the serum and beverages (wine, beer, grape juice, orange juice), 18 kinds of amino acids (aspartic acid, glutamic acid, histidine, serine, arginine, glycine, threonine, proline , alanine, valine, methionine, cystine, isoleucine, leucine, tryptophan, phenylalanine, lysine, tyrosine), reversed-phase high performance liquid chromatographic analysis method.
METHODS: Serum samples by metaphosphoric acid precipitation of protein, beverage samples by high speed centrifugation in alkaline conditions (pH 9.0) under the free amino acid and 2,4 - dinitrochlorobenzene in 90 ℃ water bath protected from light for 1.5h generate the UV absorption of the derivative product, reversed phase C18 column, UV detector, the internal standard method, or the external standard method. Analytical conditions: column: Phenomnex (USA), C18 (ODS) column, 5 μm, 250 * 4.6mm column temperature was 40 ℃; mobile phase A, acetonitrile, B, for acetic acid - sodium acetate buffer (PH = 5.20); gradient elution; velocity 1.00mL/min; detection wavelength was 360nm.
Results: The internal standard method or the external standard method of determination of 18 kinds of amino acid standard curve correlation coefficients are 0.9951 ~ 0.9999; relative standard deviation (RSD) of 1.39% to 4.67%; blood samples the detection limit is 0.20 ~ 7.72μg/ mL of beverage sample detection limit of 0.16 ~ 5.86μg/mL; serum spiked recoveries of 65.9% to 118%, drinks recovery was 56.3% ~ 125%.
Conclusion: The application to establish the method of free amino acids in 30 samples of serum, wine, beer, orange juice, grape juice. This method is simple, rapid, and accuracy of high sensitivity and good reproducibility, suitable for determination of amino acids in serum and a variety of beverages free.
Key words: high performance liquid chromatography; free amino acids; 2,4-dinitrochlorobenzene; pre-column derivatization; serum; drink
柱前紫外衍生一高效液相色谱法同时测定血清和饮料中18种游离氨基酸
赵剑虹
摘要
目的：建立血清和饮料(葡萄酒、啤酒，葡萄汁，橙汁)中18种游离氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、丝氨酸、精氨酸，甘氨酸、苏氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、酪氨酸)的反相高效液相色谱分析方法。

方法：血清样品经偏磷酸沉淀蛋白，饮料样品经高速离心后，在碱性条件(pH9.0)下游离氨基酸与2，4-二硝基氯苯在90℃水浴中避光反应1.5h，生成具有紫外吸收的衍生产物，用反相C18柱分离，紫外检测器检测，内标法或外标法定量。

分析条件：色谱柱：Phenomnex(USA)，C18(ODS)柱，5μm，250*4.6mm柱温为40℃；流动相A为乙腈，B为乙酸-乙酸钠缓冲液(PH=5.20)；梯度洗脱；流速1.00mL/min；检测波长360nm。

结果：用内标法或外标法测定18种氨基酸的标准曲线的相关系数范围均为0.9951～0.9999；相对标准偏差(RSD)为1.39％～4.67％；血样的检出限为0.20～7.72μg/mL，饮料样品的检出限为0.16～5.86μg/mL；血清加标回收率为65.9％～118％，饮料加标回收率为56.3％～125％。

结论：应用建立的方法成功地测定了血清、葡萄酒、啤酒、橙汁、葡萄汁等30份样品中的游离氨基酸。

本法具有快速简便、准确度灵敏度较高、重现性好的特点，适合于血清和多种饮料中游离氨基酸的测定。

关键词：高效液相色谱法；游离氨基酸；2，4-二硝基氯苯；柱前衍生；血清；饮料。