阿托伐他汀对转化生长因子β1诱导的肺癌A549细胞上皮间质转化过程的影响

阿托伐他汀对转化生长因子β1诱导的肺癌A549细胞上皮间
质转化过程的影响
刘洋
【摘要】Objective To investigate the effect of atorvastatin on the EMT process of A549 cells induced by TGF-β1.Methods A549 cells were cultured in vitro and exposed at different concentration in atorvastatin
(0.5,1,2μmol/L).24h later,the TGF-β1 was added to the supernatants with the concentration of 1 ng/ml.After another 48 hours co-exposed to atorvastatin and TGF-β1,the levels of EMT marker proteins (E-cadherin,vimentin) were evaluated by Western blot.Atrovastatin pretreated A549 cells were transported to transwell upper chambers.Cells on the lower surface of the filters were examined to evaluated effect of atorvastatin on the ability of migration induced by TGF-β1.FITC-phalloidine was used to make actin fibers visible by confocal laser scanning microscope and to determine the effect of atorvastasin on actin fibers induced by TGF-β1.The transcriptional factors inhibiting the transcription of E-cadherin were evaluated by Western blot.Results There was no effect of atorvastatin alone on the expression of E-cadherin and vimentin evaluated by western blot.The morphological transiton to fibroblast-like cell morphology of A549 cells pretreated with atorvastatin was inhibited under the effect of TGF-β1.During the EMT p rocess induced by TGF-
β1,compared with positive control cells (exposed to TGF-β1 only),A549 cells pretreated with atorvastatin had a higher expression of E-
cadherin,which was the marker protein of epithelial cells.On the contrary,the expression of vimentin of A549 cells pretreated with atorvastatin was lower.This result indicated that atorvastatin inhibit the EMT process induced by TGF-β1.After exposing to TGF-β1 for 24
hours,compared with positive control cells,the actin stress fibers of cells (A549 cells and NCI-H1975 cells) pretreated with atorvastatin for 24 hours were more less.Transwell experiment indicated that compared with negative control,atorvastatin could reduce the number of cells migrating to the lower surface of filters.When exposing to TGF-β1,compared with positive control cells,atorvastatin could reduce the number of cells migrating to the lower surface of filters induced by TGF-β1 either.When exposing to TGF-β1,compared with A549 cells without atorvastatin pretreatment,the expression of ZEB1 of A549 cells pretreated by atorvastatin was lower.The expression of snail and slug were similar between two A549 cells groups.In both groups snail and slug were upregulated at different time spot by TGF-β1 stimulation.Conclusion Atorvastatin can partially inhibit the EMT process of A549 Cells induced by TGF-β1,reduce the expression of transcription factor ZEB1.The generation of actin stress fibers is weakened.The migration ability increased by TGF-β1 is inhibited by atorvastatin.%目的研究阿托伐他汀对TGF-β1诱导的A549细胞上皮间质转化(EMT)过程的影响.方法体外培养肺癌A549细胞,阿托伐他汀以不同的浓度(0.5、1、2μmol/L)预处理A549细胞24h,随后,在无血清条件下加入TGF-β1(1ng/ml),共同作用48h,Western blot法检测EMT过程标志性蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、间质细胞标志蛋白波形蛋白(vimentin)的表达.体外培养
A549细胞,阿托伐他汀预处理24h后,将A549细胞种板于Transwell迁移小室,观察阿托伐他汀对TGF-β1诱导的EMT过程的细胞迁移能力的影响.异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽用来显影肌动蛋白纤维,共聚焦荧光显微镜观察肌动蛋白应力纤维的变化,研究阿托伐他汀对TGF-β1诱导的肌动蛋白应力纤维的影响.Western blot 法检测EMT过程转录因子的表达变化.结果阿托伐他汀预处理的A549细胞在TGF-β1的作用下向间质样细胞形态的转变过程受到抑制.以TGF-β1诱导EMT过程,阿托伐他汀处理组细胞E-Cadherin的表达高于阳性对照组细胞,相反,阿托伐他汀处理组细胞vimentin的表达低于阳性对照组细胞,提示阿托伐他汀抑制A549细胞EMT过程.A549细胞细胞经阿托伐他汀预处理24h后,加入TGF-β1作用24h,阿托伐他汀处理组的细胞内应力纤维的数量低于阳性对照组细胞.Transwell迁移实验,TGF-β1刺激和不刺激细胞时,阿托伐他汀预处理24h的A549细胞迁移至下室的细胞数皆少于阴性对照组细胞.阿托伐他汀预处理的A549细胞在TGF-β1的作用下,转录因子ZEB1的表达低于阴性对照组细胞,且两组细胞的Snail和Slug的表达差异无统计学意义,而在TGF-β1的作用下Snail和Slug表达都逐渐增高.结论阿托伐他汀能部分抑制TGF-β1诱导的A549细胞的上皮间质转化过程,使转录因子ZEB1的表达降低,肌动蛋白应力纤维束形成减少,TGF-β1诱导的细胞迁移受阻.【期刊名称】《医学研究杂志》
【年(卷),期】2017(046)012
【总页数】6页(P41-46)
【关键词】阿托伐他汀;非小细胞肺癌;上皮间质转化;TGF-β1
【作者】刘洋
【作者单位】100020 首都医科大学附属北京安贞医院
【正文语种】中文
【中图分类】R73
肺癌是我国病死率上升最快的恶性疾病，20世纪 70年代居癌症死因的第4位，
现已跃居第1位。

肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞脱离原发肿瘤组织，通过各种方式，到达远处组织和器官后得以继续增殖生长，形成与原发肿瘤性质相同的继发肿瘤的过程，是恶性肿瘤治疗失败和致死的主要因素。

肿瘤细胞可经多种细胞因子、生
长因子的作用发生上皮间质转化(EMT)，癌细胞获得间质细胞表型，间质表型标志蛋白vimentin 表达增加，运动迁移能力增加。

EMT 过程伴随着肌动蛋白丝的重
新排列，肌动蛋白丝聚集成束，从薄的束支变成厚的平行的可收缩的应力纤维束，与TGF-β 诱导的低分子GPT 激酶RhoA 的激活有关。

他汀类药物抑制3-羟-3-甲戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMG-CoAR)，作用于甲羟戊酸途径上游，导致下游多种产物生成减少，抑制
Ras/Rho 超家族蛋白分子的翻译后修饰，阻止蛋白锚链于细胞膜发挥正常功能。

有研究者认为，低分子GTP 激酶家族蛋白的类异戊二烯化可能只是受影响的蛋白
质的冰山一角，他汀类药物对蛋白质发挥生物学功能有更广泛的影响[1]。

研究发
现高浓度的他汀类药物能抑制肿瘤细胞的增殖，50mmol/L 的阿托伐他汀、氟伐
他汀、洛伐他汀和普伐他汀能抑制90%的MCF-7 细胞增殖，并导致肿瘤细胞出
现G1期生长停滞[2，3]。

本研究拟以TGF-β1 诱导A549 细胞的EMT 过程，观
察细胞形态、EMT 蛋白标志物E-cadherin 和vimentin 以及转录因子Snail、Slug 和ZEB1 的表达变化，以及药物对肌动蛋白应力纤维束的形成和细胞迁移功
能的影响。

材料与方法
1.材料：细胞株：人非小细胞肺癌细胞株A549 细胞购自中国科学院药物研究所。

试剂：DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′s Med ium)培养基、RPMI1640 培养基、胎牛血清(fetal calf serum，FBS)、二甲基亚砜(DMSO)、胰蛋白酶-EDTA 消化液(0.25%)购于美国Gibco公司；小牛血清白蛋白、丽春红染色液购于上海生工技术服务有限公司；抗E-钙黏蛋白抗体(一抗)购于CST 公司(3195S)；抗波形蛋白(vimentin)抗体(一抗)购于美国Abcam 公司(ab8069)；抗GAPDH 抗体(一抗)购于上海康成生物有限公司；抗β-actin 抗体(一抗)购于美国Abgent 公司；脱脂奶粉购于光明乳业；Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgG (二抗)购于Invitrogen 公司；Alexa Fluor 633 goat anti-rabbit IgG (二抗)购于Invitrogen 公司；TGF-β1 因子购于美国peprotech 公司；聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液粉末购于Dycent Biotech 公司；异硫氰酸荧光素-鬼笔环肽(FITC-Phalloidin) 、非离子表面活性剂Triton X-100 购于美国Sigma-Aldrich 公司；4%多聚甲醛，无水乙醇购于国药集团化学试剂有限公司；硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，NC膜)购于Bio-Rad 公司；蛋白预染 Marker购于美国Cell Signaling Technology公司；Supersignal west pico Chimiluminescent Substrate化学发光底物，购于ThermoFisher Scientific公司。

2.方法： (1)加药方案：观察阿托伐他汀对TGF-β1 诱导的EMT 过程的作用，接种细胞24h后，更换以含阿托伐他汀的新鲜无血清培养液处理 24h，更换无血清培养液，再每24h加入TGF-β1(1ng/ml)和阿托伐他汀，48h后提取细胞蛋白。

共 5孔，分别为对照孔(加入1μl的PBS 溶液和1μl 的DMSO)、阿托伐他汀
2μmol/L 和TGF-β1、阿托伐他汀1μmol/L 和TGF-β1、阿托伐他汀0.5μmol/L 和TGF-β1 以及阳性对照孔(仅加入TGF-β1，并加入等量DMSO)。

(2)细胞迁移Transwell 实验：取对数生长期的A549 细胞胰酶消化种板孵化 24h后，换无血清培养液，加入1μmol/L浓度的阿托伐他汀，培养 24h。

将细胞用胰酶消化，加
入含血清的DMEM 培养液，取100μl细胞混悬液计算出细胞浓度，然后将细胞
混悬液低速离心 5min，弃去上层培养液，加入不含血清的DMEM 培养液混匀，
分别取 1ml的细胞悬液至两个无菌离心管，按要求调整细胞浓度，使两个无菌离
心管中的细胞浓度为9×105/ml，一管中加入阿托伐他汀使其浓度为1μmol/L，
另一管中加入阿托伐他汀(1μmol/L)和TGF-β1(1ng/ml)。

从两管中各取100μl加入到两个Transwell 小室中。

在 24孔板的两个孔内，加入600μl含血清的培养液，并分别加入与Transwell 上室相同浓度的阿托伐他汀或者TGF-β1，再将Transwell 小室移入到含血清培养液的孔上，注意赶气泡。

阴性对照孔和TGF-β1阳性对照孔的种板方法同上，阴性对照孔中加入对应的PBS 和DMSO 溶液，阳
性对照孔加入DMSO，所用的细胞未经阿托伐他汀预刺激24h。

24h后洗去Transwell 培养孔里的培养液，分别在上下室中加入100μl与600μl冰预冷的90%乙醇，室温固定30min。

吸除 90%的无水乙醇，分别在上下两室内加入100μl与600μl的结晶紫溶液(0.5%)室温染色 15min。

将小室在水中晃动，洗去未结合的
结晶紫溶液，以棉签刮除上室的细胞，穿越膜底部的细胞经结晶紫染色可以观察计数，在倒置显微镜下观察并计数。

(3)激光共聚焦应力纤维显影实验：0.1mg
FITC-Phalloidin 溶于 0.5ml的DMSO 溶液，配成200μg/ml贮存液，分装冻存于-20℃。

薄玻璃片浸泡于乙醇溶液中消毒，后移入 12孔板内，紫外线照射消毒30min。

将胰酶消化后的A549 细胞种在12孔板中，第2天更换无血清培养液，加入阿托伐他汀1μmol/L预处理 24h，后加入TGF-β1 作用 24h，共聚焦显微镜下观察。

(4)蛋白浓度测定和定量：使用蛋白定量BCA Protein Assay Kit 试剂盒
进行蛋白浓度测定，在 96孔板中按照下表的体积添加标准浓度的蛋白样品，蛋白标准品浓度为500μg/ml，稀释后从左至右浓度为0、25、50、100、200、300、400、500μg/ml，蛋白标准品共两排复孔。

待测样品也为复孔，每孔加双蒸水
18μl，加样品2μl，稀释10倍。

以A液∶B液=50∶1比例混合AB 液，上下颠倒
数次充分混句，放置5min。

每孔加入AB 混合液200μl，轻弹96孔板混匀，37℃孵育30min后用酶标仪读取570nm波长的A值。

利用标准浓度蛋白A值制作标准曲线。

根据标准曲线得出的相应公式，即可通过待测蛋白A值计算出待测样本
的蛋白浓度。

调整各蛋白样品浓度后，以(4×Loading Buffer∶1mmol/L的DTT∶样品)为25∶10∶65配置样品凝胶电泳上样缓冲液，混匀后煮沸变性10～15min，变性后置于1.5ml离心管分装并于 -80℃储存，为防止蛋白降解尽量减少冻融次数。

(5)Western blot法检测：将配置好的聚丙烯酰胺凝胶放入电泳装置，浸在Tris-甘氨酸电泳缓冲液(25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸，pH 8.3，
0.1%SDS)中，检查确定没有漏液。

在各上样孔中缓缓加入10μl的蛋白样品，在
两边的孔中加入蛋白电泳marker，接通电源，80V的恒定电压进行电泳，待凝胶上最下方的指示带至距胶下缘 1～2cm时结束电泳，准备转膜。

其余步骤严格安
装试剂盒说明进行，使用supersignal west pico Chimiluminescent Substrate
发光底物显色，后用ImageQuant LAS4000 显色仪显色，并存储数据。

3.统计学方法：相同实验重复5次，实验数据以均数±标准差表示，釆用SPSS 16.0统计学软件对数据进行统计分析，组间比较采用t检验，多组间比较采用单
因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果
1.阿托伐他汀对EMT过程细胞形态的影响：阿托伐他汀单独作用对细胞形态的影
响不明显，A549 细胞经阿托伐他汀预处理24h后，加入TGF-β1，共同刺激 48h，细胞转变为梭形的成纤维细胞样的形态不如阳性对照组细胞(仅加入TGF-β1，并
加入等量DMSO)明显(图1)。

图1 阿托伐他汀对EMT 过程细胞形态的影响(×200)A.对照组;B.阳性对照;C.Atv 组;D.Atv+TGF-β1组
2.检测EMT 标志蛋白是否受阿托伐他汀影响：阿托伐他汀预处理的A549 细胞E-cadherin 的表达高于阳性对照组细胞，vimentin的表达则低于阳性对照组细胞。

阿托伐他汀预处理细胞后，TGF-β1 诱导的EMT 过程受到部分抑制(表1、图2)。

表1 EMT标志蛋白的相对表达量结果组别E-cadherinvimentinTGF-
β10.48±0.031.24±0.10Atv0.5μmol/L+TGF-
β10.53±0.04*0.89±0.08Atv1μmol/L+TGF-
β10.74±0.05*0.73±0.06*Atv2μmol/L+TGF-β10.81±0.06*0.62±0.05*阳性对照组0.91±0.080.49±0.02
与TGF-β1组比较，*P<0.05
3.阿托伐他汀能干扰EMT 过程的肌动蛋白应力纤维束的形成：阿托伐他汀预处理24h后加入TGF-β1 作用 24h，形成粗的平行分布的应力纤维束的数量低于阳性对照组细胞(图3)。

图2 阿托伐他汀对EMT 过程标志蛋白的表达影响
图3 激光共聚焦应力纤维显影实验结果(×400)A.阴性对照组;B.阳性对照
组;C.Atv+TGF-β1组
4.阿托伐他汀抑制TGF-β1 诱导的细胞迁移：预先暴露于阿托伐他汀 24h的A549 细胞在TGF-β1 的作用下，迁移至Transwell 下室的细胞数目明显少于阳性对照组细胞；阿托伐他汀单独作用引起的细胞迁移数目也显著低于阴性对照组细胞(不加阿托伐他汀和TGF-β1 刺激,表2、图4)。

表2 阿托伐他汀抑制TGF-β1 诱导的细胞迁移组别迁移数量阳性对照组
1936.58±161.34Atv组1479.64±128.38#Atv+TGF-β1组
4469.35±327.16*#TGF-β1组6078.63±512.39
与阳性对照组比较，#P<0.05；与TGF-β1组比较，*P<0.05
图4 阿托伐他汀抑制TGF-β1 诱导的A549 细胞迁移(×100)A.阳性对照组;B.TGF-β1组;C.Atv组;D.Atv+TGF-β1组
5.阿托伐他汀对EMT 转录因子表达的影响：TGF-β1 (1 ng/ml)按时间梯度刺激
A549 细胞，阿托伐他汀预处理组细胞EMT 过程转录因子ZEB1 的表达上调受到
抑制，刺激4h和6h所受抑制最明显，Snail 和Slug 的表达上调则不受影响(图5)。

图5 阿托伐他汀对EMT 转录因子表达的影响
讨论
由于污染加重，吸烟率的居高不下，近年来肺癌的发生率和病死率迅速升高，我国近期肺癌住院总费用年均增长速度达 16.15%，肺癌患者日均费用增长速度达
12.85%，社会经济负担日益加重[4]。

约一半患者在诊断时已属晚期，失去手术机会，预后不良。

发展中国家肺癌确诊后5年生存率低，仅5%～12%。

肿瘤转移是导致肺癌患者死亡的主要原因之一，因此对肺癌转移机制研究具有重要的现实意义[5，6]。

EMT 是指上皮细胞失去极性组织排列方式，细胞之间连接降解，细胞骨架重排，
应力纤维形成，细胞转化为成纤维细胞样形态，获得消化和迁移能力，EMT参与
组织器官形成以及伤口愈合等正常生理过程。

EMT在器官纤维化和肿瘤的侵袭转
移等病理过程中也发挥重要作用。

根据其功能的不同，一般将EMT 分为3种类型：(1)1型EMT：脊椎动物胚胎形成过程中，EMT 在胚胎早期以一种时间和空间上精确的程序化的方式参与中胚层的形成，神经脊细胞分散形成多种细胞亚型如成骨细胞、软骨细胞和肌肉细胞。

在后期阶段EMT 样过程中，允许上皮细胞转化为间质
样细胞，如心脏形成过程。

(3)2型EMT：在对炎症和损伤的反应过程中出现，是
一种基本的病理过程，伤口愈合、组织损伤修复有EMT 参与，EMT 也与炎症诱
导的纤维化有关。

(3)3型EMT：启动EMT 过程后肿瘤细胞可以脱离原发肿瘤的
环境，获得运动迁移能力，使肿瘤细胞有机会转移至远处器官，到达新环境后肿瘤细胞进行间质-上皮转化，重新获得上皮细胞的特征，增殖形成远处转移灶[7]。

肺癌患者的肿瘤组织内有EMT 转变后的肿瘤细胞存在，EMT 过程在肿瘤细胞的转
移过程中起着重要的作用，是引起肿瘤细胞转移的重要机制[7]。

TGF-β是诱导EMT 最重要的细胞因子，几乎所有细胞对TGF-β 都有反应，肿瘤
细胞也不例外[8]。

TGF-β 与细胞膜上的TGF-β 受体结合(该受体属丝氨酸/苏氨酸激酶受体)，将结合信号传递至细胞内，激活经典的Smad 信号通路，引起TGF-β反应性基因的特异性表达[8，9]。

除Smad 信号通路以外，TGF-β还能激活非经
典信号通路，如MAPK- Erk1/Erk2、PI3K-Akt/PKB 以及低分子GTP 激酶蛋白Ras、RhoA、Rac1和Cdc42 信号通路[10]。

他汀类药物能抑制甲羟戊酸途径下
游产物的合成，一些亲脂性他汀类药物能透过细胞膜，减少类异戊二烯化合物的生成。

过度表达RhoA 和RhoC 与结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌预后不良有关。

RhoA 参与EMT 过程。

他汀能抑制Rho 蛋白的类异戊二烯化，发挥抗肿瘤作用，加入香叶酰香叶酰焦磷酸能逆转这一过程。

EMT 是一个涉及很多基因改变的复杂过程，而亲脂性的阿托伐他汀具有多效性作用。

MTT 比色法检测A549 细胞暴露于浓度15μml/L阿托伐他汀 48h，细胞活
性降低 80%，1～5μml/L浓度对细胞活性没有抑制作用[11]。

本研究中阿托伐他
汀的处理浓度为 0.5～2.0μmol/L，不会抑制肿瘤细胞增殖。

A549 细胞单独暴露
于阿托伐他汀溶液 48h，EMT 过程的标志蛋白没有显著变化，细胞形态的变化也
不显著。

细胞预先暴露于阿托伐他汀 24h，加入TGF-β1 诱导EMT，肿瘤细胞转
变为成纤维细胞的形态受到抑制，EMT 过程的标志性蛋白E-cadherin 的表达高
于阳性对照组细胞，波形蛋白vimentin 的表达则低于TGF-β1 单独刺激的阳性对照组细胞，提示阿托伐他汀能抑制TGF-β1 诱导的A549 细胞的EMT 过程。

已有研究发现TGF-β刺激肿瘤细胞后，肌动蛋白丝的骨架会发生重组，分散的肌
动蛋白纤维丝会发生聚集，形成可见的聚集成束支的应力纤维[12]。

本研究用FITC 标记的鬼笔环肽染色肌动蛋白纤维，发现TGF-β1 刺激 24h A549 细胞即出
现平行分布的应力纤维束，阿托伐他汀预处理24h的细胞在TGF-β1 作用24h后，其肌动蛋白应力纤维的形成收到抑制，形成的应力纤维束支减少,提示阿托伐他汀
能抑制TGF-β1 诱导的肌动蛋白应力纤维的形成。

细胞发生EMT 后，细胞具有了间质细胞的形态，在肿瘤间质内与成纤维细胞难以鉴别，细胞的运动迁移能力增强，使肿瘤细胞更易发生转移[13]。

本研究Transwell 细胞迁移实验发现，阿托伐他汀单独作用能减少A549 细胞的迁移，阿托伐他汀预处理 24h后，A549 细胞在TGF-β1 诱导下的迁移能力较阳性对照组
也显著降低。

阿托伐他汀单独作用虽然没有诱发EMT 过程，但是也能降低肿瘤细胞本身的迁移能力，在TGF-β1 诱导的EMT 过程中，阿托伐他汀能阻止TGF-β1 诱导的细胞迁移能力的增加。

TGF-β1 下游信号传递至细胞核内，增加Snail和ZEB 家族转录因子包括Snail、Slug 和ZEB1 的表达，降低黏附连接分子E-cadherin 的表达水平，诱发EMT 过程[14]。

本研究发现当阿托伐他汀预处理的细胞接受TGF-β1刺激时，ZEB1 的表
达上调受到抑制， Snail 和Slug 的表达没有受到显著的抑制，提示阿托伐他汀通
过抑制ZEB1 的表达，削弱了TGF-β1 诱导EMT 过程的能力。

综上所述，本研究发现阿托伐他汀能部分抑制TGF-β1 诱导的 A549 细胞的上皮
间质转化过程，使转录因子ZEB1 的表达降低，肌动蛋白应力纤维束形成减少，TGF-β1 诱导的细胞迁移受阻。

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