7、发酵产物的提取与精制

固液分离
• 因为微生物和培养液的密度差小，固体颗粒也小， 离心时通常需要很大的旋转速度，能耗大。 • 此外，像高分子多糖发酵液那样黏度高的发酵液， 用离心法分离是非常困难的。 • 过滤分离：悬浮液通过过滤介质时，固体颗粒被截 留从而实现与液体的分离。滤材通常是滤布、陶瓷 膜、高分子膜等。按过滤机理不同可分为两种：
膜分离技术
• 膜分离：利用具有选择透过性的薄膜，根据膜孔径 的大小使物质透过或被截留，从而达到物质分离的 目的。基本上是一个非常节省能量的过程。
方法 膜结构 应用 微孔过滤 0.02~10μm 无菌过滤；细胞的分离浓缩 超滤 0.001~0.02μm 蛋白、多糖等高分子的分离浓缩 纳米过滤 <2nm 脱盐 反渗透 透析 电渗析 <1nm 氨基酸等低分子物质的分离浓缩； 海水淡化 大分子溶液的脱盐 氨基酸分离；去离子；海水淡化； 废水处理
• 其优点是沉淀不需进行脱盐处理，缺点是容易使蛋 白质变性，并且溶剂的消耗量大，回收率低。 • 为了防止蛋白质变性，要在低温（<0℃）下进行操 作，温度越低，收率越高。
• 因为形成沉淀的推动力是蛋白质分子间的静电引力 和偶极子的范德华力，所以溶液的pH值要控制在 等电点附近（蛋白质分子间排斥力最小）。
• 微生物细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，细胞壁 的形状和强度取决于其组成以及它们之间相互交联 的程度。细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程 度高的是最难破碎的。
革兰氏阳性菌 革兰氏阴性菌
酵母菌
霉菌
壁厚nm 层次 组成
20~80 单层 肽聚糖（4090%）；胞壁 酸
10~13 多层 肽聚糖（510%）；脂多 糖
• 通常是向蛋白质溶液中添加高浓度的(NH4)2SO4、 Na2SO4等无机盐，使蛋白质达到过饱和而析出。
• 盐析广泛地用于各类蛋白质和酶的初级纯化和浓缩。 对杂质含量较高的发酵液，可采用反复盐析沉淀并 结合其它沉淀法进行高度纯化。
沉淀法
• 有机溶剂沉淀法：将能与水互溶的有机溶剂添加到 蛋白质溶液中，蛋白质会沉淀析出。一般使用丙酮、 乙醇，还可以用DMSO、异丙醇等。
本课内容
发酵产物的提取与精制
固液分离 菌体破碎 产物的分离提取
产品的成品化处理
无菌处理 干燥、浓缩 冷藏保存
发酵工程
• 发酵工程可分成三个部分：
① 上游工程： • 优良菌株的选育、制作 • 最适发酵条件的确定：pH、温度、溶氧、营养成分 • 培养基的制备 ② 发酵： • 培养基、发酵罐、空气的灭菌 • 生产过程中的加料、实时监测、计算机自动控制 ③ 下游工程： • 固液分离、细胞破碎 • 目标产物的分离、纯化 • 废液处理 • 产品的精制、包装
– 滤饼过滤：以滤布为过滤介质，当悬浊液通过滤布时， 固体颗粒被阻拦，逐渐在表面堆积形成滤饼，达到一 定厚度时即起到过滤作用。适用于固体含量 >0.1g/100ml的悬浊液。
固液分离
• 澄清过滤：以硅藻土、活性炭、砂等介质填充于过 滤器内，或用烧结陶瓷、烧结金属等组成滤层。由 介质起主要的过滤作用。 • 从过滤开始就能获得清澈的滤液，适用于固体含量 <0.1g/100ml、颗粒直径在5~100μm的悬浊液。
• 增加流动相的疏水性、降低 盐浓度、增加去污剂都可以 把疏水性的分子洗脱下来。
树脂颗粒
结晶法（晶析）
• 结晶是由分子规则排列形成 的，晶析的目的是从溶液中 以结晶形态回收目标产物。
• 生物制品如氨基酸、蛋白质、 药品原药等，其最终产品形 态多是在最后阶段通过晶析 操作生产的晶体性粉末。
• 优良的晶体：纯度高、粒子 半径较一致、容易过滤、保 存稳定性好、流动性好。
发酵下游加工过程的特点
• 产品种类繁多：有乙醇、氨基酸等小分子物质，也 有酶、蛋白质等生物大分子。 • 小分子产品稳定性好，分离技术可选范围较宽，大 分子稳定性差，制约了下游技术的选择范围。 • 产物浓度低：尽管可以利用基因工程改造而获得高 产菌株，但是在生产中，多数目的物在发酵液中仍 然以很低的浓度存在（如Ile，2.4%；胰岛素，几十 毫克/千克）。 • 一般情况下，浓度越低，提取成本越高；步骤越多， 提取收率就越低。
吸附法
• 吸附：用固体吸附剂处理液体或气体混合物，将其 中所含的一种或几种组分吸附在固体表面，从而使 混合物的组分彼此分离。
• 在生物产品的生产中，常用吸附剂进行脱色、脱臭、 去热原、组胺等少量杂质，也用于蛋白质、核酸、 抗生素等的分离。
• 优点：操作简便，设备简单；可不用或少用有机试 剂；生产过程pH变化小；适用于稳定性较差的生 物产物。 • 缺点：选择性差，得率不太高。
初筛
砂滤
微孔过滤
超滤
超滤ultrafiltration
滤膜
• 超滤在生物制品的浓缩和纯化中应用广泛：柠檬酸、抗 生素、氨基酸、蛋白质。
始态
终态 反渗透, RO 渗透压
半透膜
污水
半透膜
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膜分离技术
• 在生物工艺中，可以利用这些膜分 离方法从分子大小大的物质开始， 依次回收。
固液分离
• 首先要将发酵液中的菌体和液体进 行分离，方法有两种：基于密度差 的离心法和基于颗粒直径大小的过 滤法。 • 离心法：利用高速转动产生的离心 力分离液体中的固体颗粒。优点是 分离速率快、液相澄清度好，缺点 是设备投资高、能耗大。 • 工业生产中应用最广泛的离心机是 碟片式离心机，最大处理量达到 300m3/h，适用于细菌、酵母菌等 多种微生物细胞的大规模分离。
• 纯度 客户品质保证 • 固体形态：多态性，盐， 水合物…… • 颗粒大小分布、形态、密 度、吸湿性、颜色…… • 物理和化学稳定性
结晶法
• 为了使化合物以结晶状态析出，常常要使溶液过饱 和。生物产品的晶析常用方法有：
① 冷却结晶法：把在温度比较高的情况下饱和的溶液的 温度降低，使其析出晶体。适用于溶解度随温度降低 而明显降低的物质。 ② 蒸发结晶法：加热蒸发溶剂，使溶质过饱和而析出。
– 适用于大多数微生物，但丝状菌和较小的革兰氏阳性 菌容易造成阀门堵塞，产生包涵体的基因工程菌易损 伤匀浆阀。
• 非机械法：条件温和，但破碎效率较低。
– 酶解法：常用的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、壳多糖酶等。
产物分离方法
沉淀法
吸附法
膜分离法 层析法 结晶法
沉淀法
• 沉淀法是生物生产工艺最具代表性的分离纯化方法 之一，是纯化的第一阶段—粗分离时常用的方法。 • 沉淀法的本质是通过改变条件，使溶质分子或胶体 颗粒在液相中的溶解度降低，分子发生聚集，从而 达到分离、澄清、浓缩的目的。
③ 贫溶剂结晶法：贫溶剂是指能与溶剂互溶，但却难以 溶解目的物质的溶剂。向溶液中添加贫溶剂，可以使 目的物质过饱和而析出。
发酵下游加工过程的特点
• 杂质多：发酵液中含有大量可溶性和不溶性的杂质，种 类多，含量高，给下游加工过程带来困难。 • 活性易丢失：许多生物产品一旦离开生物体活性很容易 被破坏，特别是酶、蛋白质类的产品，对分离提取过程 中的条件特别敏感，往往使能够采用的方法十分受限。 • 质量波动大：由于生物的某些不确定因素，不同批次发 酵液中产物的收率和质量会有很大波动，因而要求下游 技术的适用面要宽，操作弹性要大。 • 安全要求高：特别是药品、食品，必须完全除去有害物 质、热原(pyrogen)以及来源于原材料或培养基的异种蛋 白质、病毒颗粒与核酸。
生物产品的分离纯化
• 与普通的化学工业产品不同，发酵产品多数是与人 类生命直接相关的食品、药品，对安全性、纯度的 要求较高。
• 必须使用与普通化学工艺不同的分离纯化方法，以 有效获得高纯度的产品。 • 所以发酵工业生产对下游加工过程有着特殊的要求， 并且占据了大部分的生产成本（50~70%）。
• 此外，随着生物工业的快速发展，废水污染问题也 越来越突出，为了‘可持续发展’，清洁生产已是 一个重要的要求。
胰岛素
上图：美国航天飞机和俄国 空间站上所长出的蛋白质和 病毒晶体，包括canavalin、 thaumatin。 左图：不同的雪花，Wilson Bentley，1902
J-STAR Research, Inc. 专门提供药物结晶流程的研究服务
API：活性药物成分
晶体 药物产品 • 生物利用率 • 有效性 • 安全性
• 优点：过程简单、成本低、原材料易得、便于小批 量生产等。缺点：沉淀中杂质较多，产品纯度低， 需重新精制。
• 沉淀法广泛用于抗生素、有机酸、蛋白质等的工业 生产。
沉淀法
• 常用的沉淀法有：盐析法、有机溶剂沉淀法和等电 点沉淀法等。 • 盐析法：低浓度盐离子会使蛋白质的溶解度增大— 盐溶；但是盐浓度继续增大时，蛋白质的溶解度开 始降低，从溶液里沉淀析出—盐析。
生物产品分离的一般流程
发酵液 预处理 固液分离 加热、调pH、絮凝 离心、过滤 机械法、酶解法 浓缩、沉淀、吸附、萃取、超滤 层析法、结晶 浓缩、干燥、杀菌
细胞破碎
产物的粗分离 精制 成品制作
发酵液的预处理
• 降低黏度：发酵液的黏度大，使下面的过滤步骤速 度很慢。通过加水稀释（啤酒、黄酒、酱油等）或 加热（如链霉素，70 ℃ 半小时），可使黏度大大 下降，过滤速率增大许多倍。 • 调整pH：能影响某些成分的表面电荷性质和电离 度，改善发酵液的过滤特性（Lys，pH4.0）。 • 凝聚与絮凝：向发酵液中添加化学药剂（电解质、 絮凝剂），改变菌体细胞及蛋白质等胶体粒子的分 散状态，使其凝结成较大颗粒，有利于过滤。
① ② ③ ④ 大小（分子量）：凝胶过滤层析 电荷性质：离子交换层析 生物学亲和性：亲和层析 疏水性质：疏水相互作用层析
层析法
• 疏水相互作用层析：也称反 相层析法。其固定相是非极 性的，而流动相是极性的。
• 基质常是用8C或18C的烷烃链 所修饰的二氧化硅，疏水性 的分子会倾向于被吸附到疏 水性的基质上，亲水性分子 先被洗脱下来。
纸层析
• 层析法既能用于少量物质的分析鉴 定，又可用于大量物质的纯化制备。
柱层析
层析法
• 固定相：是层析的基质，可以是固体或液体，能与 待分离物质进行可逆的吸附。常用的材料有硅胶、 琼脂糖、葡聚糖等。
• 流动相：层析过程中推动固定相上待分离物质朝着 一个方向移动的液体、气体等。称为洗脱剂。
• 不同的层析法主要利用分子的四种特性：
吸附法Βιβλιοθήκη • 常用的吸附剂包括有机类（活性 炭、纤维素、合成树脂）和无机 类（硅胶、氧化铝、氢氧化铝）。
• 活性炭：多孔含碳物质的颗粒粉 末，吸附力强，价格便宜（万能 吸附剂）。常用于脱色、除臭， 以及糖、氨基酸、多肽等的分离。
• 硅胶：多孔的SiO2，吸附性能高、 热稳定性好、化学性质稳定、有 较高的机械强度。可用于氨基酸、 萜类、生物碱等的分离。
100~300 100~250 多层 多层 葡聚糖 多聚糖 （30-40%）（80-90%）
肽聚糖
常用破碎方法
• 机械法：
① 珠磨法：细胞悬浮液在碾磨腔中与极细的玻璃珠（直 径<1mm）一起快速搅拌研磨，使细胞破碎。
② 高压破碎法：利用高压（55-70MPa）使细胞悬浊液通 过针型阀，造成细胞破碎。是大规模破碎细胞的常用 方法，破碎速度快，破碎率高。
目标产物：①细胞
②细胞内高分子
或
③细胞外分泌产物
离心
离心 或 细胞破碎 离心 沉淀 上清
包涵体
上清
缓冲液冲洗 离心 上清
上清
离心 上清
纯化 复性
脱水、干燥
纯化
破碎菌体
• 微生物的代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数小 分子代谢物。此外细菌产生的碱性蛋白酶、霉菌产 生的糖化酶等也分泌到细胞外。
• 但大多数酶、蛋白质、脂类和部分抗生素等都位于 细胞内，要提取这些产物，首先必须将细胞破碎， 使产物释放出来。
• 例如：从发酵液中制备分泌到菌体 外的酶时，首先用微孔过滤除去培 养液中的菌体和固体培养基成分， 滤过液中含有蛋白质等高分子物质。
• 接着，将滤过液用超滤法处理，回 收高分子物质。必要时，进一步用 反渗透法从滤液中分离回收小分子 物质。
层析技术
• 层析法：是一种移动速度差分离法。 被分离物质由于物理、化学和生物 学特性的不同，在流动相和固定相 之间的分配系数不同，导致它们的 移动速度不同而彼此分离。 • 最大的特点是分离效率高，能分离 各种性质极相类似的物质。在蛋白 质类生物产品的高度分离纯化中发 挥着重要作用。