红色荧光蛋白

红色荧光蛋白
荧光蛋白是一种生命科学领域必不可少的光学成像工具，荧光蛋白可以被用来进行活细胞成像，运用荧光蛋白可以标记蛋白的表达，有些蛋白质组学的实验也可以通过利用荧光蛋白来实现，绿色荧光蛋白（greenfluorescent protein, GFP）、红色荧光蛋白（red fluorescent protein, RFP）、橙色荧光蛋白（orange fluorescent protein, OFP）是目前比较常用的荧光蛋白，这些荧光蛋白被广泛的应用到细胞成像中。

1999年红色荧光蛋白首次被报道，与绿色荧光蛋白相比优
点显而易见，首先红色荧光蛋白能够与GFP共同使用，解决一些GFP单独解决不了的科学问题；其次作为红色荧光蛋白激发和发射波长更长，最重要的是其在细胞内成像时背景低。

最早用于研究的红色荧光蛋白DsRed是从珊瑚虫中克隆出
来的，在紫外光的照射下可发射红色荧光，荧光强、稳定性好应用前景广泛。

但是它自身还存在着很多的缺陷，比如DsRed的寡聚状态表现为四聚体，在进行蛋白融合时容易形成多聚体影响目标蛋白。

而且它的成熟时间长，在细胞内容易产生细胞毒性等。

这些缺陷对其应用造成了一定的限制，这就促使科学家不得不对其进行结构改造。

红色荧光蛋白变种mCherry是一种目前被广泛用于生物技
术作为示踪剂的红色荧光染料，包括分子的标记和细胞组分的定
位等。

mCherry因为其颜色和单体分子的光稳定性，细胞毒性低。

比其它荧光蛋白标签更优异，其最大激发光和发射光分别为
587nm和610nm。

从结构上看突变体mcherry能够具有如此强的竞争力有2个原因。

1，mcherry中的第163位Lys已经突变成了Gln，这个突变的氨基酸所在的侧链位于发色团苯环下方，在结构中能够清楚的看到163位的Lys与发色团的苯环之间由氢键相互作用。

荧光蛋白中的发色团是去质子化的，主要原因在于发色团在蛋白质内部与蛋白所处环境的吸光度有所不同，据此我们相信163位的Lys 是被质子化的，也因此通过氢键与发色团相互联系。

这种相互作用能够稳定DsRed的电子密度，降低了发色团苯环的活跃性。

而突变体中用中性的Glu替代酸性的Lys，这将导致这个位点与发色团的距离增加，从而维持一个相对较弱的氢键。

这就引起发色团处于一个相对活跃的状态，从而能够产生更亮的荧光。

2，83位的Lys突变为Leu。

有一个荧光亮度增强的突变体，在这个位点上也发生了突变不过将Lys突变为Met，在后者突变体的结构中能够看出79位Lys向着Met的方向移动，这个方向刚好是远离发色团的方向。

在mcherry中也观察到70位Lys有类似变化，因此可以认为70位Lys能够帮助发色团处于稳定状态，而Lys的远离能够使其处于一个活跃的状态，在激发荧光时产生更亮的荧光。