微RNA在乙型肝炎病毒感染不同时期表达谱的变化及其意义

微RNA在乙型肝炎病毒感染不同时期表达谱的变化及其意义秦海瑜;陈宇辉
【摘要】Objective To evaluate the expression profile and significance of miRNA different periods of HBV infection. Methods Two hundred patients infected by HBV from Lingao County People′s Hospital dur-ing Mar. 2012 and Jan. 2014 were selected in this study. Among them,there were 50 patients with acute hep-atitis B,50 with chronic hepatitis B,50 with hepatitis B liver cirrhosis,50 with liver cancer and 50 healthy control. The expression level of miR-20a,miR-21,miR-31,miR-145,miR-222,miR-191,miR-371,miR-223 and miR-126 were detected by xMap liquid chip technology after extracting mononuclear cells from peripheral blood. Results There were no statistically differences of miR-21miR-31, miR-145, miR-222, miR-191, miR-371 in different groups(P>0. 05). As the progression of the disease,the expression level of miR-20a increased significantly,while miR-126 decreased greatly. The expression level of miR-223 was the highest in acute hepatitis B group (15.44 ±8.52),while it was the lo west in the liver cancer group (6.87 ±2.11), the difference was statistically significant(P<0.
05). Conclusion The expression profile of miRNA in dif-ferent periods of HBV infection is different,which provides a new clue to the research of the mechanisms of the chronicity of HBV infection.%目的：探究微 RNA
( miRNA )在乙型肝炎病毒感染不同时期表达谱的变化及其意义。

方法选取2012年3月至2014年1月于临高县人民医院就诊的乙型肝炎病毒( HBV )感染者200例,其中急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝硬化、肝癌患者和健康对照组各50例,
提取外周血中单个核细胞后,分离信使RNA,采用RNA-DNA嵌合探针液态芯片技
术检测miR-20a、miR-21、miR-31、miR-145、miR-222、miR-191、miR-371、miR-223、miR-126的表达水平。

结果不同时期HBV感染者外周血单个核细胞中miR-21、miR-31、miR-145、miR-222、miR-191、miR-371的表达水平比较,差异无统计学意义；miR-20a的表达水平随HBV 感染的发展而升高, miR-126随 HBV 感染的发展而降低, miR-223在急性乙型肝炎中的表达水平最高(15．44±8．52),在肝癌组中的表达水平最低(6．87±2．11),差异均有统计学意义(P<0．05)。

结论 HBV感染发展不同时期的miRNA表达谱是不同的,通过检测相关miRNA的表达,可以为HBV感染的慢性化发展提供一个新的研究视角。

【期刊名称】《医学综述》
【年(卷),期】2015(000)019
【总页数】3页(P3647-3649)
【关键词】肝癌;微RNA;乙型肝炎
【作者】秦海瑜;陈宇辉
【作者单位】临高县人民医院检验科，海南临高571800;临高县人民医院检验科，海南临高571800
【正文语种】中文
【中图分类】R512.62
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一种嗜肝DNA病毒，我国1～59岁人
群中HBV携带率约为7.18%[1]。

感染HBV后肝脏反复损伤和修复可以引发慢性乙型肝炎，随着病程迁移，有可能进一步发展为肝硬化，甚至肝癌[2]。

最近研究
发现，微RNA(microRNA，miRNA)在HBV感染的相关疾病中可能起到重要作用[3]，但是目前HBV感染者、慢性乙型肝炎、肝硬化患者和肝癌患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中miRNA的表达水平变化鲜有报道。

为准确地检测患者病情的动态发展过程，本研究通过检测HBV感染相关肝病不同阶段患者PBMC中相关miRNA的变化，探究miRNA在HBV感染相关肝病中的作用及其在临床治疗中的意义。

1.1 一般资料选取2012年3月至2014年1月于临高县人民医院就诊的HBV 感染者200例。

纳入标准：参照中华医学会传染病与寄生虫分会、肝病学分会于2010年联合修订的《慢性乙型肝炎防治指南》[4]。

排除标准：检测前接受过放化疗的患者，患有其他(如自身免疫性肝炎、脂肪肝、酒精肝、药物性肝病等)肝脏疾病的患者，妊娠期妇女，严重心、肾疾病患者。

依据患者诊断情况分为：急性乙型肝炎50例，男30例、女20例，年龄34～61岁，平均(46±12)岁；慢性乙型肝炎50例，男25例、女25例，年龄33～60岁，平均(43±10)岁；肝硬化50例，男28例、女22例，年龄32～59岁，平均(45±10)岁；肝癌50例，男30例、
女 20例，年龄32～60岁，平均(49±11)岁。

对照组50例，为在临高县人民医院进行体检的健康人，男25例、女25例，年龄34～59岁，平均(44±12)岁。

各组患者及健康对照的性别和年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法
1.2.1 试剂Ficoll淋巴细胞提取液(上海研卉生物科技有限公司)，总RNA提取
试剂盒(Labaide)，RNA酶抑制剂(上海合星生物科技有限公司)，Trizol(大连宝生
物有限公司)，微球(Bio-Rad)，探针序列和微球捕捉序列(上海生工生物工程有限
公司)，RNA-DNA嵌合探针(上海吉玛生物公司)。

1.2.2 仪器离心机(Termo)，PCR仪(Bio-Rad)，紫外分光光度计(上海仪电分析仪有限公司)，Luminex液态芯片分析系统(Luminex)。

1.2.3 检测方法①标本采集：常规采集患者外周血5 mL，稀释后加入Ficoll淋巴细胞提取液，以重力加速度500 g离心10 min，后用毛细管吸出灰色的PBMC。

②总RNA的提取：在分离出的PBMC中加入1 mL Trizol，反复吹打。

严格按照总信使RNA提取试剂盒说明提取总RNA，然后用紫外分光光度计测定其吸光度
值(A)，当A260/A280的比值在1.9～2.1，且其最低浓度高于250 mg/L时加入RNA酶抑制剂，储存于-80 ℃冰箱备用。

③RNA-DNA嵌合探针液态芯片检测miRNA：实验中用到的探针序列和微球捕捉序列均用Oligo 6.0软件设计，并由
上海生工生物工程有限公司合成，具体详见表1；实验中使用miR-103作为内参，将待检样本和内参在PCR仪中与嵌合探针进行杂交后，加入包被好的微球，反应30 min后在反应体系中加入2.5 μL酶切反应液，30 ℃下反应30 min；最后加入荧光染料，在Luminex液态芯片仪上检测荧光；检测时取内参读数的3次荧光信号平均读数作为有效内参数值，取(靶miRNA分子平均荧光强度-对应本底平均荧光强度)/(有效内参荧光强度-对应本底平均荧光强度)为有效数据。

1.3 统计学方法应用SPSS 17.0对数据进行统计学分析，计量资料用均数±标
准差±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q法，
P<0.05为差异有统计学意义。

miR-20a、miR-223、miR-126这三种miRNA在各组间的表达差异均有统计学
意义(P<0.05)。

miR-20a在肝癌组中的表达水平高于对照组、急性乙型肝炎组、
慢性乙型肝炎组和肝硬化组(P<0.05)；其在肝硬化组中的表达水平高于对照组、
慢性肝炎组和急性肝炎组(P<0.05)；其在慢性乙型肝炎组中的表达也稍高于对照
组和急性乙型肝炎组，但差异无统计学意义(P>0.05)。

miR-223在肝癌组的表达
水平低于对照组、急性乙型肝炎组和慢性乙型肝炎组(P<0.05)；其在肝癌组中的
表达水平也稍低于肝硬化组，但差异无统计学意义(P>0.05)；miR-223在肝硬化
组的表达水平也低于急性乙型肝炎组(P<0.05)。

miR-126在肝癌组中的表达水平
低于对照组、急性乙型肝炎组和慢性乙型肝炎组(P<0.05)；miR-126 在肝硬化组
中的表达水平低于对照组和急性乙型肝炎组(P<0.05)；其在肝癌组中的表达稍低
于在肝硬化组中的表达，但差异无统计学意义(P>0.05)。

各组miR-21、miR-31、 miR-145、miR-222、miR-191、miR-372比较差异无统计学意义(P>0.05)。

见表2。

miRNA是一种以序列特异性调控相关基因转录后表达的内源性非编码的单链小RNA，普遍参与发育、增殖、分化、凋亡、炎症等一系列生理及病理过程[5]。

miRNA可与目的基因的3′端非翻译区结合，通过碱基配对导致目的信使RNA降解，或者通过非完全碱基配对阻碍信使RNA的翻译[6]。

目前为止miRBase数据
库中已有1424种人类的miRNA、720种小鼠的miRNA和408种大鼠的miRNA [7]。

利用miRNA来诊断甚至治疗疾病已成为热点[8- 9]。

miRNA不仅存在于各种细胞中，而且可被释放到循环系统中，并可以在大多数体液中检测到。

本研究结果表明，miR-21、miR-31、miR-145、miR-222、miR-191、miR-
371在HBV感染者和对照组PBMC中的表达水平差异无统计学意义，提示这5
种miRNA与HBV感染及各个时期的发展没有关系。

miR-20a的表达水平随着HBV感染的发展而逐步提高，提示miR-20a可能参与了HBV感染者病情的发展
过程，还可能是肝癌的重要致病性miRNA分子之一。

miR-223在急性乙型肝炎
中表达量最高，在肝癌组表达量最低；miR-126的表达水平随着HBV感染的发展而逐步降低，提示miR-223和miR-126这两种miRNA的表达水平可能与HBV
的慢性化发展紧密相关。

miR-20a在多种疾病中均报道有异常表达情况，可能起
着癌基因的作用[10]。

如在胆囊癌患者组织中miR-20a表达水平显著高于正常人，且随着病情的加重miR-20a的表达量升高[11]；miR-20a在胃癌组织中也存在高表达情况，其可能也与胃癌的原位发生密切相关[12]。

miR-223的表达水平在肝
癌患者中最低，在急性乙型肝炎患者中最高；miR-126的表达水平随着HBV感染
的发展而逐步降低，说明这两个miRNA的表达水平可能与HBV感染的不同时期
有关。

miR-223为粒细胞系中高表达的一种控制炎性反应的分子[13]。

曾有报道，miR-223基因缺失的小鼠粒细胞表型高度成熟，对刺激的敏感度、杀菌功能均有
所增强，导致小鼠易患肺炎，组织损伤加剧[14-15]。

本研究在HBV感染发展程
度最高的肝癌患者PBMC中的表达量明显偏低，可能会引起粒细胞功能过强，从
而引起高炎症反应。

这可能也是HBV感染后病情发展的一个因素。

miR-126位于EGFL7 基因的内含子中，在正常人含血管丰富的组织中高表达。

miR-126是一种
抑癌基因，目前普遍认为其可以抑制一些肿瘤的增殖和转移，其在胃癌、乳腺癌、原发性膀胱肿瘤等疾病中表达量明显降低[16]。

综上所述，从HBV急性感染经过慢性乙型肝炎、肝硬化发展到肝癌的过程中不同miRNA的表达谱可能会随着病情的发展而变化。

本研究结果显示，miR-
20a、 miR-223、miR-126三种miRNA的表达水平均随着HBV感染后病情的发展而变化，通过监测相关miRNA的变化可以为相关疾病的发展机制提供新的研究视角。

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统一同一时体论：宇宙无限。

包括万事、万物；有机、无机；生命、非生命；物质、精神等，所有都包容在宇宙体内，是一个统一体，是一个完整的体系。

宇宙间的任何个体，都发生在某时间段与变化的空间内，所以任何个体均是时间和空间共同构建成的同一时体。

宇宙间的任何个体被各种各样的规律控制着，若大的宇宙与大小不一的个体，都在循道规律而动。

无限与有限，宏观与微观，整体与部分都遵循着统一同一时体和谐的运动。

和谐地运动维护了统一，运动地和谐维护了同一。