新型重组融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL部分表征的鉴定

新型重组融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL部
分表征的鉴定
合毒索蛋白B7-2.PE40KDEL2
新型重组融合毒素蛋白B7.2.PE4OKDEL部分表征的鉴定①
关海容孙玉英袁志宏张惠丽梁飞刘楠郭斯启习彩霞奚永志
(北京军事医学科学院附属医院免疫学研究室及国家生物医学分析中心免疫学研究室,北京100071)
157?
中国图书分类号R392.11文献标识码A文章编号1000-484X(2008)02-0157-04
[摘要]目的:对构建的新型重组B7-2.PE40KDEL外毒素融合蛋白的部分表征进行分析鉴定.方法:采用SDS—PAGE
相对分子量,胰蛋白酶消化的MALDI.TOF.MS质谱,蛋白印迹,全波长扫描和MTr法分别测定该融合蛋白相对分子量,肽谱,
抗原特异性以及靶向杀伤生物学活性.结果:B7-2.PE40KDEL经12%SDS—PAGE蛋白电泳和凝胶成像系统分析计算,其相对
分子量为72628,与理论预测值69561相比误差在5%之内;全波长扫描分析显示该目的蛋白分别在225am和276nm处各
有一吸收峰;MALTI.TOF.MS质谱测定共获得15个与理论预测值相符的肽段,经瑞士生物信息研究所的EXPASY分子生物服
务网站的Peptident数据库搜索证明,在分子量为60000—80000的范围内未检索到与上述条件相符的已知蛋白,证明本融合
蛋白为全新蛋白,与我们预测的目的蛋白相符;Westernblot实验显示B7—2一PE40KDEL能与人B7-2及PEA抗体特异性结合;
MTr杀伤活性测定表明,该融合蛋白对表达CD28的人T淋巴瘤细胞系Jurkat产生特异性杀伤,而对不表达的CD28一淋巴细
胞系Raji无任何杀伤.结论:重组B7.2.PE40KDEL外毒素融合蛋白为一全新的具有靶向B7:CD28细胞杀伤活性的蛋白质.
[关键词]重组外毒素融合蛋白;B7.2.PE40KDEL;肽谱;抗原特异性;生物学活性AnalysisofbiochemicalandphysicalpropertiesforanewrecombinantB7? PseudomonasexotoxinfusionproteinB7-2.PE40KDEL
GUANHai-Rong,SUNY u-凡g,YUANZhi—Hong,ZHANGHui-Li,LIANGFei,Nan,GUOSi-Qi,XICai—
Xia,XIy0凡g-Zhi.DepartmentofImmunology,AffiliatedHospitalforAcademyofMilitaryMedialSciences,Labo- ratoryofImmunoassayNationalCenterofBiomedicalAnalysis,Beijing100071,China [Abstract]Objective:Identificationofsomebiochemicalandphysicalpropertiesforanewrecombinant B7-2一PE40KDELexo—
toxinfusionprotein.Methods:12%SDS—PAGEseparatingandgelimaginganalyzing,peptidemassfi ngerprinting,Westernblotand MTrassasyingwereusedrespectivelyforidentificationoftheprotein.Results:Molecularweightofthere combinantB7-2一PE40KDEL
was72628.5%ofthedifferencetoitstheoreticalvalue69561.TheresultofWesternblotindicatedthatthe purifiedrecombinantB7—
2-PE40KDELcouldspecificallybindwithmAbanti—humanB7-2andtheantibodyagainstPEA,while thenegativecontroldidnot.The
recombinantB7-2一PE40KDELdigestedwithtrypsinandthendetectedbyMOLTI—TOF—MS.Itwasshownthatthedetecte d15peptides
liedintheextracellularpartofB7—2andthetruncatedPseudomonasextoxinPE40KDEL.Searchingint hepeptidentdatabankofEx.
pasywebsite,wedidnotfindanyknownproteinswhichwasaccordantwiththeaboveterms.Thecytotoxi cactivityoftherecombinant
toxinwithMTrmethodshowedthattheB7-2一PE40KDELselectivelykilledJurkatcelllinewhichexpressesedCD28receptorwelland hadnokillingeffectontheRajicelllineunexpressingCD28receptor.Conclusion:RecombinantB7-2.P E40KDELexotoxinfusionpro. teinweconstructprovestobeanewonewithtargetedkillingbioactivitytoB7:CD28system. [Keywords]Recombinationexotoxinfusionprotein;B7-2一PE40KDEL;Peptidemassfingerprinting;Antigenspecificity;Biogical
activity
20世纪80年代末国外科学家开始探索细胞因
子_夕毒素融合蛋白的结构与功能,国内这一领域的
①本文为国家自然科学基金资助课题(No.302001l1)
作者简介:关海容(1979年一),男,硕士,实习研究员,主要从事分子
血液/免疫学相关的基础与应用基础研究;
通讯作者及指导教师:孙玉英(1973年一),女,副研究员,主要从事分
子血液/免疫学相关的基础与应用基础研究;
奚永志(1964年一),男,研究员,博士生导师,
主要从事分子血液/免疫学相关的基础与应用
基础研究.
研究亦随之起步….为了改善或克服目前国际上
阻断B7:CD28/CTLA一4共刺激信号系统诱导免疫
耐受防治GVHD或HVGD策略中所存在的缺陷或
弊端,研创出能特异性防治或减弱GVHD和HVGD
的新一代措施,我们研究室以B7:CD28/CTLA4系
统为靶标,采用基因融合SOE策略,在国际上首次
成功构建了全新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7.
1-PE40KDEL及B7-2一PE40KDEL的表达载体4J.
通过对其表达的优化以及下游的分离纯化,我们可
以获得大量高纯度的该重组蛋白,因此有必要对该
融合蛋白的物化表征进行详细的分析,以作为确证
B7-2一PE40KDEL为全新蛋白极其重要的依据.因为从蛋白质工程的角度来讲,对于任何一个功能性
蛋白质而言,无论是天然存在还是按照人们意愿设
计改构,定点诱变乃至于融合重组研制的,无论是生
物合成的还是基因工程表达的,一旦获得一定数量
的纯品,除了要系统深入地研究其结构序列,生物学
功能外,还要对其表征进行充分的研究,这在基因工
程产品的鉴定中,美国FDA的药批规章中已有明确的硬性规定.
1材料与方法
1.1材料
1.1.1重组融合蛋白与靶细胞本研究室构建纯
化分离的高纯度B7-2一PE40KDEL融合蛋白.Jurkat (CD28受体阳性)和Raji细胞(CD28受体阴性)分
别为人T和B淋巴细胞白血病细胞系,本室保存. 1.1.2主要试剂彩色低分子量蛋白marker(Gib—
CO公司);CAN(色谱级,华美公司);TFA(色谱级, ACROS公司);PVDF膜(POLE公司);胰蛋白酶(测
序级)及兔抗PE多抗(Sigma公司);鼠抗B7-2单抗(ANCELL公司);碱性磷酸酶标记的羊抗鼠及碱性
磷酸酶标记的羊抗兔(华美公司);PE标记的CD28
单抗(Beckman公司);胎牛血清(56℃灭活,华美公司).
1.1.3主要实验仪器MiniProteinH型蛋白电泳
仪,蛋白电转仪及酶联仪550型(Bio—Rad公司); ReflexⅢ型质谱仪(Bruker公司);Gel—Pro3.1凝胶
成像系统(MediaCybemetic公司);分光光度计
DU640及离心机(Beckman公司);CO培养箱(Rev—CO公司).
1.2方法
1.2.1Westernblot印迹实验将纯化后的目的蛋
白液分别制样进行10%SDS—PAGE蛋白电泳,除去PAGE胶的浓缩胶部分.将分离胶胶片与硝酸纤维
素膜用转移缓冲液平衡30分钟,并将专用滤纸用转移缓冲液浸湿.按照半干转移仪说明操作,将蛋白
转移到膜上;用含10%的小牛血清/PBS/叠氮钠封
闭液封闭2小时,然后加入两种一抗孵育1～2小时;再用PBS洗涤3次,用0.1mmol/LTris—HC1,
0.05mol/LNaC1洗涤,尽量将磷酸盐洗净;再用
10%小牛血清,Tris—HC1,作为二抗体稀释液稀释二抗,二抗与膜孵育1小时;随后用0.1mol/LTris—
HC1,0.15mol/LNaC1至少洗涤3次,最后用NBT/ BCIP试剂盒进行显色,至适当的显色程度用蒸馏水
中国免疫学杂志20o8年第24卷
洗去染色液终止反应.
1.2.2胰蛋白酶酶解凝胶肽谱的制备将纯化的
B7-2一PE40KDEL进行10%SDS—PAGE电泳后,经考马斯亮蓝染色,脱色,将凝胶上相应的蛋白带切下,
用干净的解剖刀将胶带切成1～2mm.大小的胶
片,用水清洗几次后用含50%ACN的25mmol/L碳
酸氢氨溶液50～100l浸泡胶片,震荡20分钟,弃
去溶液,重复1～5次,使蓝色完全褪去.将上述处
理的凝胶真空冷冻离心干燥20分钟,以使胶片完全
脱水体积缩小,而后加入25mmol/L碳酸氢铵稀释
的胰蛋白酶5～10l(0.01g/1),在4~C冰箱放
置20～30分钟,待酶液完全被吸收后,补充5～10
l25mmol/L碳酸氢铵液,37℃保温15小时.加
5%TFA50～100l,于40℃保温1小时,吸出上清
液,再加含2.5%TFA的50%ACN50～100l,于
30~C保温1小时,吸出上清液,合并上清液,冰冻干
燥12小时.最后加5～10l0.5%的TFA溶液,混
均后做MALDI—TOF—MS质谱.
1.2.3相对分子量的测定将蛋白相对分子量标
准及B7-2一PE40KDEL纯化样品进行12%SDS—PAGE 电泳后,用考马斯亮蓝R-250染色,脱色后利用凝胶
成像系统进行相对分子量的计算.
1.2.4全波长扫描采用Beckman公司的DU640
型分光光度计对纯化后的目的蛋白进行了200～
600nm波长扫描.
1.2.5MTr法检测特异性杀细胞活性分别收集
处于对数生长期的Jurkat细胞和Raji细胞,将细胞
用RPMI1640洗3遍后计数,以5×10个/孔的细胞
浓度加入96孔培养板中,将纯化的蛋白以0.22m
孔径的滤膜过滤除菌后,按照2倍梯度稀释后分别
加入各细胞培养孔中,37oC,5%CO全湿度培养72
小时,用MTr法检测B7-2一PE40KDEL融合蛋白的
细胞毒杀伤作用.
2结果
2.1重组B7-2一PE40KDEL融合蛋白的免疫印迹鉴
定其结果证实所分离纯化的产物均能与B7-2单
克隆抗体和PEA多抗发生特异反应,在70000处出
现强烈的反应带,而阴性对照在相应位置则未见任
何显色条带,见图1,2.
2.2重组B7-2一PE40KDEL融合蛋白的肽谱分析
本实验采用了胰蛋白酶法进行酶解B7—2一PE40KDEL 融合蛋白,经MALTI—TOF—MS质谱测定,共获得15
个肽段,见图3,这些肽段均可以在B7-2一PE40KDEL
中找到相对应的部分,见表1.将上述结果经瑞士
合毒素蛋白B7-2一PE40KDEL
生物信息研究所的EXPASY分子生物服务网站的Peptident数据库搜索显示,在分子量为60000～
80000左右的范围内未检索到与上述条件相符的
已知蛋白,由此证明本融合蛋白为全新蛋白,与我们
23
图1免疫印迹(抗B7-2单抗)
Fig.1WesternblotwithmAb(anti-B7-2l
Note:Lt~ffle1.Negativecontrol;Lane2.Purifiedaimedprotein;Lane 3.Colormarker.
23
图2免疫印迹(抗PEA多抗)
Fig.2Westernblotwithantibody(anti-PEA)
Note:Lane1.Unpurifiedaimedprotein;Lane2Purifiedaimedprotein; L%ne3.Concentratedaimedprotein.
誊露誉泰量氅蓑罢詈鼋运妻
景薯墓墨ii氧蔫摹毒
袁
露
◇
LL1.L...J-J.”～…..止.～～.J…j～～.2300m/z
图3胰蛋白酶切后MOLT][-TOF-MASS检测结果
Fig.3ResultofMOLTI-TOF-MASSafter~tttlngbytrypsin
2l59
预测的目的蛋白完全相符.
2.3重组B7.2.PE40KDEL融合蛋白的分子量分析
根据12%SDS.PAGE蛋白电泳的结果(图4)和凝
胶成像系统分析结果(图5)所示,进行相对迁移率
计算可知,重组B7-2.PE40KDEL融合蛋白的相对分
子量为72628,与理论预测值69561相比,误差在
5%之内.
2.4重组B7-2.PE40KDEL融合蛋白的全波长扫描
分析全波长扫描分析B7-2一PE40KDEL的结果显
示,该目的蛋白分别在225nm和276nm处各有一
吸收峰,见图6.
表1胰蛋白酶切所获肽段质核比及对应氨基酸序列
Tab.1Themass.to-chargeratioinmassspectrometryof peptidesobtainedaftercuttingbytrypsinandcor- respondencesequenceofaminoacid
Them/zofThecorrespondence
sequenceofaminoacid
SSLPGFYR
LV ALYLAAR
UGHPU’LR
GTQNWTVER
NQDLDAIWR
LAI肌.AAAESER
TSFDSDSWTLR
LSWNQVDQVIR
NSTIEYDGIMQK
EKFDSVHSKYMGR
NALASPGSGGDLGEAIR NYPrGAEFIGDGGDGVSFSTR
GFYIAGDPALAGY AQDQEPDAR GYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVR LDAITGPEEEGGRLErrILGWPLAER
)tloesegrm
925.466
989.65l
l0l5702
1090589
ll30.600
l244675
1314.562
1357718
l398810
1584.803
l614.836
2O9OO23
2488.190
2574.426
2722.415
2
kD
97.4
66.2
43.O
31.O
20.1
14.O
图4纯化后的B7-2-PFAOKDEL蛋白电泳结果
Fig.412%SDS-PAGEresultofpurifiedB7-2-PFA0KDEL protein
Note:Lane1.Purifiedaimedprotein;Lane2.Lowmolecularmarker. nN0.晷N
图5SDS-PAGE凝胶扫描结果
Fig,5TheresultofSDS—PAGEscanning
图6纯化后117-2-PFAOKDEL全波长扫描分析
Fig.6SpectrumscanninganalysisofthepurifiedB7-2一
E4OKDEL
图7B7-2一PFAOKDEL融合毒素的细胞毒实验
F培7DetectingcytotoxicactivityofB7-2一PE40KDELby M[TI’meth od
2.5MTI’法检测特异性杀细胞活性M1,IT的结果
显示,重组融合蛋白在10ng/ml的剂量下对Jurkat
细胞有显着的杀伤效应,剂量达到1000ng/ml其
杀伤效率可达90%,计算其LD5.为160ng/ml.而
对CD28阴性的Raji细胞,即便是在2000ng/ml的
剂量下也未观察到任何杀伤效应,Raji细胞生长良
中国免疫学杂志20o8年第24卷
好.由此初步证实我们所设计构建的全新型重组
B7-2一PEAOKDEL融合蛋白对CD28阳性靶细胞是具有选择性杀伤效应的,见图7.
3讨论
通过选择性阻断B7:CD28/CTLA.4共刺激信
号系统以达到特异性诱导免疫耐受用来防治HVGD
和GVHD这一新策略的科学性,特异性及可行
性.因此,对所构建纯化的重组B7-2.PE40KDEL
融合蛋白进行物化表征方面的鉴定就显得十分重
要.本研究通过免疫印迹和肽质纹谱首先确定了我
们所表达纯化后的蛋白与我们所设计构建的蛋白完
全一致;同时采用两种不同的抗体进行免疫印迹实
验,一种是B7-2单抗,证明我们所表达的蛋白含有
B7-2的胞外区;另一种是PEA多抗,证明我们所构
建的重组蛋白含有PEA毒素.以PEA多抗进行免
疫印记结果中的未纯化样品可见多条显色条带,分
析认为一部分为非特异性显色,而另一部分为目的
蛋白的降解带;而纯化后的样品的免疫印记结果未
见非特异性显色.
肽质纹图是近几年随着蛋白质组研究而迅速普
及开来的一项技术,这项技术的特点就是敏感,快速,
所需样品量小,一般而言,完全酶切所得的4个肽段
就可以确定一种蛋白质,我们酶切所得的15个肽段
分别位于B7-2胞外区部分和绿脓杆菌外毒素部分,
这充分证明我们所表达的序列与设计构建的相一致,
而经瑞士生物信息研究所的EXPASY分子生物服务
网站的Peptident数据库搜索,未检索到与上述条件
相符的已知蛋白,证明此融合蛋白为全新蛋白.
我们采用凝胶扫描通过计算标准蛋白相对迁移
率绘分子量.相对迁移率半对数曲线,计算出目的蛋
白B7-2.PE40KDEL的分子量为72628,与理论值69
561相比,误差在5%之内.我们还通过互联网采用
Expasy网站的ProtParamTool软件对我们的目的蛋
白进行了分析,理论等电点为5.25.
Mqq”法是一种检测细胞存活和生长的方法.
此方法的特点是灵敏度高,重复性好,操作简便,无
放射性污染,且与其它检测细胞活力的方法如H—
TdR等有良好的相关性.采用MTr法检测了我们
所构建的融合蛋白的特异性杀伤活性显示,在1O
nml的剂量下,融合蛋白对于CD28受体阳性的T
淋巴细胞系Jurkat的杀伤效应即有显着杀伤作用,
计量达到1000ng/IIl1时杀伤效率达90%,而对于
CD28受体表达阴性的B淋巴细胞系Raji无任何杀
(下转第166页)
000OO0000H::m鸲%
00000000
166?
瘤提供了实验依据.
4参考文献
1TallmanMS.NewstrategiesforthetreatmentofacuteMyeloidinclu—dingantibodiesandotherlevelagents[J].Hematology,2005:10:143—150.
2EricF,ChristineE,ArnaudFeta1.V olumeChangesofIsolatedHu. mallK562leukemiacellsinducedbyelectricfieldpulses[J].Bio—technologyandBioengineering,2000;67(5):520-528.
3WeaverJC.Electroporation:adramatic,non—thermalelectricfield phenomenon.inproceedingsofthefirstworldcongressforelectricity andmagnetisminBiologyandmedicine[M].LakeBuenaVista, Florida:AcademicPress,1992:14—19.
4Y aoChenguo,SunCaixin,MiY aneta1.Studyonelectroporationof cellmembraneandtumortratment[J].HighvoltageEngineering, 2004;30(1):45-50.
5HofmannGA,DevSB.Electmporationtherapy:anewapproachfor thetreatmentofheadandneckcancer[J].IEEETransactionsonBi—omedicalEngineering,1999;46(6):752-759.
6ThuongP.Effectsofdifferentpulsingcharacteristicsontransformation efficiencyviaelectro—potation.2002,http://www.Genetronics. Corn/press/pt050802.
7JeyamkondanS,JayasDS,HolleyRA.Pulsedelectricfieldpro一(上接第160页)
伤作用.此实验一方面验证了我们所构建的重组蛋
白具有特异性杀伤活性;另一方面,也建立了批量生
产我们所构建的重组蛋白的活性监测方法.
总之.本研究所表达纯化的重组B7-2一PE40KDEL
融合蛋白能特异性靶向杀伤表达CD28受体的人T
细胞,部分物化表征鉴定及国际Peptident数据库证
实重组B7-2一PE40KDEL融合蛋白确为一全新的蛋
白质,这为我们今后更深人地研究该融合蛋白的生
物学特性,尤其是在体内外防治GVHD或HVGD的
应用研究奠定了基础.
4参考文献
1刘爽,奚永志.细胞因子一受体介导靶向杀伤白血病细胞的新
策略[J].中华内科学杂志,1999;38(5):416—418.
2关海容,奚永志.靶向B7/CD28信号系统治疗GVHD的新策略[J].中华器官移植杂志,2002;23(3):190—192.
3袁志宏,奚永志,孔繁华eta1.编码人B7-2胞歪曲外区cDNA的克隆,表达及生物活性鉴定[J].中国实验血液学杂志,2002;10 (6):508-511.
4袁志宏,奚永志,孔繁华eta1.新型重组免疫抑制蛋白B7-2一L—PE4OKDEL的分子构建与生物活性及结构分析[J].中华医学杂志,2002;82(11):1541—1545.
中国免疫学杂志2008年第24卷
cessingoffoods:areview[J].JFoodProt,1999;62(9):1088.
1096.
8BeebeSJ,FoxPM,RecLJeta1.Nanosecondpulsedelectricfield (nsPEF)effectsoncellsandtissues:apoptosisinductionandtumor growthinhibition[J].IEEETransonPlasmaScience,2002;30(1):
286-292.
9LiLH,RamaS,SteohanieFeta1.Highlyefficientlargevolume flowelectroporation[J].TechnologyinCancerResearchandTreat—meut,2002;1(5):341-349.
10KylarovaD,ProchazkovaJ,parisonofthe TUNEL,laminBandannexinVmethodsforthedetectionofapopto- sisbyflowcytometry[J].ActaHistochemica,2002;104(4):367—370.
11BalasubramanianK,BeversEM.WillemsGMeta1.Bindingofan—nexinVtomembraneproductsoflipidperoxidation[J].Biochemis—try,2001;40(30):86724676.
12BrattonDL,FadokV A,RichterDAeta1.NakamuraTarsi, HensonPeterM.Polyamineregulationofplasmamembranephos—pholipidflip—flopduringapoptosis[J].JBiolChem,1999;274 (40):28113-28120.
[收稿2007—08—04]
(编辑许四平)
5陈执中,章月华.现代生化药物与基因工程药物分析[M].上
海:上海医科大学出版社,1999:67-87.
6MarshakDR,KadnagJT,BurgessPReta1.Strategiesforprotein purificationandcharacterization[M].NewY ork:ColdSpringHarbor LaboratoryPress,1996:49-56.
7夏其昌.蛋白化学研究技术与进展[M].北京:科学出版社, 1999:1一.
8TazzariPL,PolitoL,BolognesisAetaLImmunotoxinscontaining recombinantanti—CTLA一4single—chainfragmentvariableantibodies andsaporin:invitroresultsandinvivoeffectsinanacuterejection
model[J].JImmunol,2001;167:4222—4229.
9WoodwardJE,SchaeferA T,ZottolaLBeta1.Inhibitionofinvitro donor—specificproliferativeandcytotoxicTcellresponsesinchimeric CD40ligand—deficientbonemarIowtransplantrecipientstreatedperio—perativelywithCTLA4一Ig[J].TransplantProc,2001;33:113—
114.
1OHowlandKC,AusubelLJ,LondonCAeta1.TheroleofCD28
andCD40ligandinTcellactivationandtolerance[J].JImmunol,
2000;164:4465—4470.
[收稿2006.11-30修回2007—05—11]
(编辑张晓舟)。