碱处理对大米蛋白分子间作用力的影响

碱处理对大米蛋白分子间作用力的影响
责任编辑：admin 发布时间：2007-12-14
易翠平1姚惠源2谢定1
(长沙理工大学生物与食品工程学院1 ,长沙410076)
(江南大学食品学院2 ,无锡214036)
摘要：通过研究碱处理对大米谷蛋白分子间作用力的影响,表明蛋白浓度9% (w/v)时,蛋白的黏度和表面疏水性大幅上升。

9%(w/v)的谷蛋白含量条件下,pH<11.5,大米谷蛋白分子间作用力不发生变化;pH11.5～12.5,谷蛋白分子内与分子间的二硫键与巯基发生交换反应,产生聚集同时疏水基团暴露; pH13.0,部分谷蛋白分子的二硫键与巯基被破坏; pH13.5,谷蛋白分子的二硫键含量显著降低。

关键词：碱处理；大米蛋白；黏度；表面疏水性；巯基与二硫；键热特性
在蛋白质的提取和加工过程中常常无可避免的用碱处理,强碱处理高浓度的蛋白时,蛋白质的理化特性会发生较大的变化,巯基与二硫键之间发生交换反应[1]或者β-消除反应等[2-3]。

碱处理对蛋白质分子结构的影响, Ishino等报道了碱变性大豆蛋白的分子间相互作用[1]; Gaucher-Choquette等报道了碱处理对牛血清蛋白、免疫球蛋白、12S油菜籽蛋白等五种蛋白质的黏度和巯基及二硫键的影响[4], Ch2ing-YungMa等报道了碱处理对燕麦球蛋白理化特性的影响[5],关于碱处理对大米蛋白的分子结构的影响,国内外尚未见报道。

1材料与方法
1. 1材料与设备
大米谷蛋白,根据参考文献6制备。

提取出来的蛋白用凯氏定氮法检测蛋白质含量为99.8%,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检验谷蛋白纯度为91.5%。

主要设备有NDJ-79型旋转式黏度计,UV-1100型紫外可见分光光度
计,HITACHI650-60荧光分光光度计,差示扫描量热仪(Pyris)。

1. 2试验方法
1. 2. 1 碱处理大米谷蛋白的制备
将不同浓度的大米谷蛋白用不同pH值的氢氧化钠室温(25℃)搅拌1h,用
1mol/L的盐酸调中性,透析,冷冻干燥后低温保存。

1. 2. 2 黏度测定
将不同pH值处理1h的大米谷蛋白样品倒入样品槽,搅匀,开机使转子在蛋白液中转动,到指针恒定时记下读数。

1. 2. 3 差示扫描量热分析(DSC)
样品用0.04mol/L NaOH溶液配成8%的蛋白溶液,平衡过夜,取湿基5～10mg,用液体坩埚密封后放入DSC测定蛋白热特性曲线;其中温度扫描范围30～120℃,扫描速率20℃/min,参比:三氧化二铝石英管。

1. 2. 4 表面疏水性测定
将样品用0. 01mol/L、pH11.5Na2 HPO4-NaOH缓冲液稀释至0.002%、0.004%、0.008%、0.016%,取20μL的1-苯胺基-8-萘磺酸(1 - anilino - 8 -naphthalene sulfonic acid,ANS)溶液(8mmol/LANS溶液溶于0.01mol/L磷酸盐缓冲液)加入
4mL上述配置的蛋白溶液,立即摇匀,在荧光分光光度计中于390nm激发470nm检测发射荧光强度,用荧光强度对蛋白溶液浓度作图并进行线性回归,以线性回归斜率作为表面疏水性的指标。

1. 2. 5 巯基与二硫键分析
15mg样品用1mLTris -甘氨酸缓冲液混匀后加4. 7g盐酸胍,用缓冲液定溶至10mL。

测定巯基时,取1mL该液加4mL脲-盐酸胍溶液和0. 05mL 5, 5’-二硫代- 2 -硝基苯甲酸,于412nm处测取光吸收值。

测定二硫键时,取1mL溶液,加0. 05mL 巯基乙醇和4mL脲-盐酸胍溶液,于25℃保温1h,然后加入10mL12%的三氯乙酸,继续于25℃保温1h, 3 000r /min离心10min,用5mL12%的三氯乙酸清洗沉淀物2次,将沉淀物溶于10mL8mol/L脲中,加0. 04mL5, 5’-二硫代- 2 -硝基苯甲酸,于412nm处测取光吸收值。

计算公式为:
μMS m /g = 73. 53A412×D /C
其中: A412———412nm吸光值;
C———样品浓度(mg/mL) ;
D———稀释因子,巯基取5. 02,总巯基(巯基+还原二硫键)取10。

2结果与讨论
2. 1碱处理对大米谷蛋白黏度变化的影响
图2不同pH溶液中大米谷蛋白的黏度变化(9%的蛋白浓度)
图1表明在pH12. 5的碱液浓度下,在1%～7%的浓度范围内,大米谷蛋白的黏度随蛋白含量的增加略有增加,至9%时大米谷蛋白的黏度迅速增加到1 400mPa·S,形成凝胶。

表明在pH12. 5的碱液浓度下,从9%的蛋白浓度开始大米谷蛋白分子间发生相互作用。

图2表明9%的蛋白浓度下, pH值小于11时,碱液中大米谷蛋白的黏度变化不大, pH值超过11,黏度迅速增大, pH值至12,黏度达到最大,开始呈下降趋势, pH值超过13,黏度减小到初始值。

2. 2碱处理对大米谷蛋白表面疏水性的影响
大米谷蛋白的碱变性与其浓度有关,当谷蛋白的浓度小于7%时,蛋白的表面疏水性基本维持不变,当谷蛋白浓度达到9% ,其表面疏水性大幅上升,说明此时蛋白的分子构象开始变化,疏水小区暴露。

当pH值小于11. 5时,蛋白的表面疏水性基本维持不变,当pH值在12. 0～12. 5之间时蛋白的表面疏水性增大,说明此时蛋白的分子构象开始变化,疏水小区开始暴露;当pH值大于13. 0时,蛋白的表面疏水性减小, pH值至13. 5,蛋白的表面疏水性降至4 313,说明pH值大于13. 0,大米谷蛋白的肽链降解,降解增加的亲水基团羧基端和氨基端增加蛋白的亲水性,疏水性降低。

2. 3碱处理对大米谷蛋白巯基与二硫键的影响
pH12.5的碱处理对不同浓度大米谷蛋白巯基与二硫键的变化没有显著影响,但均比谷蛋白的巯基与二硫键含量有所降低。

由表2可见,9% ATRP在pH < 12. 0时,巯基与二硫键含量变化不大, pH > 12. 5开始,巯基与二硫键含量开始降低; pH在13. 5时,二硫键含量已经显著降低。

2. 4碱处理对大米谷蛋白热特性的影响
蛋白质从天然态到变性态的转变是一个热的综
合效应,包括氢键断裂的吸热反应和疏水键断裂的放热反应[7] ,二者导致的焓变用差示扫描量热仪(DSC)测定后用于研究多种食品蛋白的变性[ 8 ] ,比如大豆蛋白的热变性[ 9 ] , pH、盐及表面活性剂对燕麦蛋白[ 10 ]的热特性影响等。

表3结果表明pH12. 5时,大米谷蛋白的变性峰值温度及热焓随着蛋白浓度增加而增加,在蛋白浓度低于7%时,增加不明显;当蛋白浓度达到9%时,蛋白的变性峰值
温度由85～86℃迅速增加到92. 119℃,热焓也上升到80. 944J /g。

9%ATRP在pH10. 5～12. 5范围内,大米谷蛋白的变性峰值温度及热焓随着pH值的增加而增加;超过12. 5,变性峰值温度及热焓下降。

ZhiYong Ju研究认为DSC峰值温度及热焓
随着蛋白颗粒的增大而升高、水解度的增加而降低[ 7 ] ,从本实验结果看来, pH13. 0～13. 5变性峰值温度及热焓下降应该是由于谷蛋白在碱液中水解引起的,变性峰值温度及热焓随着pH值的增加在10. 5～12. 5范围内增加可能是由蛋白聚集引起的。

3小结
pH12. 5的碱液浓度处理蛋白浓度为1%～7%(w /v)的大米谷蛋白,黏度变化不明显;蛋白浓度至9% (w /v)时,黏度迅速增加,形成凝胶。

9% (w /v)的蛋白浓度下, pH < 11时,碱液中大米谷蛋白的黏度变化不大, pH > 11,黏度迅速增大, pH12时,黏度最大,开始呈下降趋势, pH > 13,黏度减小到初始值。

pH12. 5时,碱处理大米谷蛋白的表面疏水性变化与蛋白浓度有关,谷蛋白浓度< 7% (w /v)时,蛋白的表面疏水性基本维持不变,谷蛋白浓度达到9% (w /v) ,表面疏水性大幅上升。

当谷蛋白浓度9% (w /v) , pH < 11. 5时,蛋白的表面疏水性基本维持不变,pH
在12. 0～12. 5之间时蛋白的表面疏水性增大;pH > 13. 0时,蛋白的表面疏水性减小, pH13. 5,蛋白的表面疏水性降至很低。

pH12. 5的碱处理对不同浓度大米谷蛋白巯基与二硫键的变化没有显著影响,但均比谷蛋白的巯基与二硫键含量有所降低。

9% (w /v)的谷蛋白含量条件下, pH < 12. 0时,巯基与二硫键含量变化不大, pH > 12. 5,巯基与二硫键含量开始降低; pH13. 5时,二硫键含量显著降低。

碱处理大米谷蛋白的热特性表明, pH12. 5时,大米谷蛋白的变性峰值温度及热焓随着蛋白浓度增加而增加,在蛋白浓度低于7% (w /v)时,增加不明显;当蛋白浓度达到9% (w /v)时,蛋白的变性峰值温度由85～86℃迅速增加到92. 119℃,
热焓也上升到80. 944J /g。

9%ATRP (w /v)、pH10. 5～12. 5时,大米谷蛋白的变性峰值温度及热焓随着pH的增加而增加,超过12. 5,变性峰值温度及热焓下降。

参考文献
[ 1 ] K. Ishino , S. Okamoto. Molecular interaction in alkali
de2natured soybean p roteins. Cereal Chem. 1975, 52: 9 - 21 [ 2 ] 张英君,陈有亮,董雅芳1碱处理引起蛋白质的变旋和赖丙复合物的生成1肉类工业, 2001 (2) : 31 - 36
[ 3 ] Hung - Min Chang, Cheng - Fang Tsai , Chin - Fung L i. Changes of amino acid composition and lysinoalanine for2mation in alkali - p ickled duck eggs. J. Agric. Food Chem. 1999, 47: 1495 - 1500
摘自：《中国粮油学报》2007年第4期。