棉籽分离蛋白制备工艺研究

棉籽分离蛋白制备工艺研究
赵小龙;刘大川;刘晔;黄鑫;黄良哲
【摘要】With defatted cottonseed meal as raw material, the method of alkaline extraction and acid pre-cipitation was used to prepare cottonseed protein isolate. Using extraction rate of protein and content of protein as the indexes, the effects of extraction temperature, extraction time, pH and ratio of liquid to solid on the extraction of cottonseed protein isolate were considered. Moreover, SDS-PAGE was used to analyze the relative molecular weight distribution of protein subunit in cottonseed protein isolate prepared. The results showed that the optimal extraction conditions of cottonseed protein isolate were obtained by or-thogonal experiment as follows:extraction temperature 60℃, extraction time 60 min, pH 10 and ratio of liquid to solid 14∶1. Under the optimal conditions, the extraction rate of cottonseed protein isolate reached 73. 21%, the protein content of the cottonseed protein isolate was 90. 76%( N × 6. 25 , dry ba-sis ) , and the content of free gossypol reduced from 0. 12% to 0. 033%. The relative molecular weights of protein subunit in cottonseed protein isolate were main 59. 3 kDa and 53. 7 kDa, reaching 47. 66%.%以脱脂棉籽粕为原料,采用碱溶酸沉法制备棉籽分离蛋白。

以蛋白质提取率、产品蛋白质含量为指标,考察提取温度、提取时间、pH、液固比对棉籽分离蛋白提取效果的影响。

另外,采用SDS-PAGE对所制备棉籽分离蛋白中蛋白质亚基相对分子质量分布进行了分析。

结果表明,通过正交实验优化得到棉籽分离蛋白最佳制备工艺条件为：提取温度60℃,提取时间60 min,pH 10,液固比14∶1。

在最佳工艺条件下,蛋白质提取率为
73．21%,产品蛋白质含量为90．76%( N ×6．25,干基),且游离棉酚含量由原料
的0．12%下降到0．033%。

棉籽分离蛋白中蛋白质亚基相对分子质量主要为59．3 kDa与53．7 kDa,占47．66%。

【期刊名称】《中国油脂》
【年(卷),期】2014(000)012
【总页数】4页(P31-34)
【关键词】脱脂棉籽粕;棉籽分离蛋白;碱溶酸沉
【作者】赵小龙;刘大川;刘晔;黄鑫;黄良哲
【作者单位】武汉轻工大学食品科学与工程学院，武汉430023;武汉轻工大学食品科学与工程学院，武汉430023;武汉轻工大学食品科学与工程学院，武汉430023;武汉轻工大学食品科学与工程学院，武汉430023;武汉轻工大学食品科
学与工程学院，武汉430023
【正文语种】中文
【中图分类】TS229;TQ936.2
我国棉花资源丰富，棉花加工的副产物——棉籽经脱壳制油后的饼粕中蛋白质含
量高达40%～50%，远胜过稻米、小麦，除蛋氨酸稍低外，其余必需氨基酸均达
到了联合国粮农组织(WHO)的推荐值，营养价值远比谷类蛋白高[1-3]。

世界卫生、食品和农业组织，联合国儿童基金蛋白顾问小组建议游离棉酚不超过0.06%、总
棉酚不超过1.2%的棉籽仁可供人类食用；而美国食品和药物管理局(FDA)规定，
对于人食用的去腺体棉籽粉，游离棉酚允许量不超过0.045%。

国外已成功将棉籽
蛋白应用于食品工业，将棉籽蛋白添加到肉制品、饮料、烘烤制品、面包、糕点中可以改善品质或增加口感[4-5]。

Arthur等[6]研究了不同提取溶液和不同酸溶液对棉籽蛋白制备效果的影响，结果表明，Na2SO3溶液作为提取溶液和H2SO4溶液作为酸沉溶液制得的棉籽蛋白效果最佳。

刘军等[7]以棉籽粕为原料，对几种不同的棉籽蛋白提取方法以及脱毒方法进行了比较，得到最佳工艺条件为提取液pH 10.71、提取温度60.2℃、提取时间1.07 h和液固比16.7∶1。

结果表明，热碱法既能使蛋白质提取率达到60%和产品蛋白质含量达到90%，且还有很好的脱酚效果，游离棉酚含量低于200 mg/kg。

白雪等[8]以棉籽粕为原料，采用碱提酸沉方法提取棉籽蛋白，正交实验得到最优提取工艺条件为提取液pH 11.5、提取温度60℃、提取时间2 h和液固比15∶1，制得棉籽分离蛋白产品蛋白质含量为90.69%，蛋白质提取率为69.85%，游离棉酚含量仅77.35 mg/kg，与棉籽粕相比降低了89.9%。

但是热碱法提取的棉籽分离蛋白产品的色泽由于受到多酚氧化酶的影响而氧化褐变[9]。

本文以低温脱脂棉籽粕为原料，采用碱溶酸沉法制备棉籽分离蛋白，以蛋白质提取率，产品蛋白质含量为指标，考察提取液pH、提取温度、提取时间、液固比对棉籽分离蛋白提取效果的影响，并对碱溶法蛋白质提取液用乙醇进行洗涤，以脱除棉籽分离蛋白中的多酚化合物，避免受到多酚氧化酶的影响而氧化褐变，达到护色的目的。

另外，本文还采用SDS-PAGE对所制备棉籽分离蛋白中蛋白质亚基相对分子质量分布进行了分析。

1 材料与方法
1.1 实验材料
低温脱溶棉籽粕，由河北衡水中棉工业棉花产业化有限公司提供。

原料低温脱溶棉籽粕基本成分见表1。

表1 原料低温脱溶棉籽粕基本成分 %水分粗蛋白(N×6.25,干基)残油率游离棉酚
NSI5.8349.580.670.1224.46
凝胶配制试剂盒，博士德生物工程有限公司；标准蛋白，重庆科润生物医药研发有限公司。

其他化学试剂均为分析纯。

501超级恒温水浴锅；单列式电热恒温水浴锅；818台面式pH测定仪，奥利龙公司；JB 90-D 强力电动搅拌机；DW-GL100超低温冷冻储存箱，中科美菱低温科
技有限责任公司；LD5-10 低速离心机；SCA210电子天平，托利多常州仪器有限公司；电子分析天平，奥豪斯(上海)公司；垂直电泳仪；BIO-RAD 凝胶成像分析
系统。

1.2 实验方法
1.2.1 测定方法
原料粗蛋白含量及产品蛋白质含量的测定，GB/T 5009.5—2010,其中氮转换系数
取6.25；水分的测定，GB/T 5009.3—2003；游离棉酚的测定，苯胺比色法[10]；残油率的测定，GB/T 5512.5—1985；氮溶解指数(NSI)的测定，NY/T 1205—2006。

1.2.2 棉籽分离蛋白制备工艺
将低温脱溶棉籽粕粉碎过100目筛。

准确称取15.0 g棉籽粕粉，加入一定比例蒸馏水，在一定温度下调节pH搅拌一定时间后，以3 500 r/min离心15 min，得到提取液，经95%乙醇洗涤后在pH 4.8条件下进行酸沉[11]，沉淀经水洗至中性后冷冻干燥，即得棉籽分离蛋白产品。

按下式计算蛋白质提取率。

蛋白质提取率=提取液中蛋白质质量/原料中蛋白质质量×100%
1.2.3 SDS-PAGE电泳
采用5%的浓缩胶和12%的分离胶。

浓缩胶电压为60 V，分离胶电压为80 V。

分离完成后，用0.25%考马斯亮蓝R250染色2～4 h，弃去染色液，用蒸馏水把胶
面漂洗几次，然后加入脱色液，直到蛋白质带清晰为止[12]。

2 结果与讨论
2.1 碱提单因素实验
2.1.1 提取温度对棉籽分离蛋白提取效果的影响
在提取时间为60 min、pH为11、液固比为14∶1的条件下，研究不同提取温度对棉籽分离蛋白提取效果的影响，结果如图1所示。

图1 提取温度对棉籽分离蛋白提取效果的影响
由图1可见，蛋白质提取率及产品的蛋白质含量均随着提取温度的上升而升高，
但蛋白质提取率上升趋势在60℃后逐渐平缓，而蛋白质含量在60℃后则明显下降。

其原因可能是由于提取温度较高导致蛋白质变性所致。

故选择提取温度为60℃较
为合适，并以50、60、70℃为正交实验该因素的水平。

2.1.2 提取时间对棉籽分离蛋白提取效果的影响
在提取温度为60℃、pH为11、液固比为14∶1的条件下，研究不同提取时间对棉籽分离蛋白提取效果的影响，结果如图2所示。

由图2可见，在提取时间小于60 min时，蛋白质提取率和蛋白质含量均随提取时间延长而上升，在提取时间超过60 min后，蛋白质提取率基本保持不变，蛋白质含量呈下降趋势。

这可能是由于非蛋白质成分也被浸提溶出所造成的。

故选择提取时间为60 min较为合适，并以40、60、80 min为正交实验该因素的水平。

图2 提取时间对棉籽分离蛋白提取效果的影响
2.1.3 pH对棉籽分离蛋白提取效果的影响
在提取温度为60℃、提取时间为60 min、液固比为14∶1的条件下，研究不同pH对棉籽分离蛋白提取效果的影响，结果如图3所示。

图3 pH对棉籽分离蛋白提取效果的影响
由图3可见，蛋白质提取率和蛋白质含量均随着pH增大而上升。

当pH小于10时，蛋白质提取率和蛋白质含量均呈明显上升趋势，这是由于蛋白质随着pH升高
溶解度逐渐增大的缘故；当pH大于10以后，蛋白质提取率和蛋白质含量均基本保持不变，但产品色泽会随着pH增大而逐渐加深。

故选择pH为10较为合适,并以9、10、11为正交实验该因素的水平。

2.1.4 液固比对棉籽分离蛋白提取效果的影响
在提取温度为60℃、提取时间为60 min、pH为10的条件下，研究不同液固比
对棉籽分离蛋白提取效果的影响，结果如图4所示。

图4 液固比对棉籽分离蛋白提取效果的影响
由图4可见，蛋白质提取率和蛋白质含量均随着液固比的增大而上升，但液固比
大于14∶1后，蛋白质提取率有所下降，蛋白质含量基本保持不变。

考虑液固比
过大会造成生产成本增大，故选择液固比为14∶1较为合适，并以12∶1、14∶1、16∶1为正交实验该因素的水平。

2.2 碱提正交实验
为优化碱提工艺条件，根据单因素实验结果，以液固比、pH、提取温度与提取时
间为因素，蛋白质提取率和蛋白质含量为指标，设计L9(3)4正交实验，因素水平
见表2。

将蛋白质含量(X)、蛋白质提取率(Y)转换为蛋白质含量隶属度和蛋白质提
取率隶属度，采用综合评分法分析实验结果，综合评分结果见表3，方差分析见表4。

表2 因素水平水平A液固比B pHC提取温度/℃D提取时间/min 112∶1 95040 214∶1106060 316∶1117080
表3 正交实验结果注：蛋白质含量隶属度=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)；蛋白质提取率隶属度=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)；综合分=蛋白质含量隶属度×0.6+蛋白质提
取率隶属度×0.4。

实验号ABCD蛋白质含量/% 蛋白质提取率/%蛋白质含量隶属
度蛋白质提取率隶属度综合分1111185.4269.56 00.420.172122291.98
70.931.000.710.883133386.1372.310.111.000.464212390.3567.590.75
00.455223188.3871.440.450.820.606231290.3268.790.750.250.557313285.8 171.600.060.850.388321387.76
69.210.360.340.359332188.7870.420.510.600.55k10.5030.3330.3570.440k20 .5330.6100.6270.603k30.4270.5200.4800.420R0.0760.2770.2700.183
表4 方差分析因素离差平方和自由度均方F显著性
A0.01120.0061.000B0.11320.05610.214 显著C0.09920.0508.929显著
D0.05120.0264.655误差0.01120.006
由表3可以看出，影响棉籽分离蛋白提取效果的因素主次顺序为B>C>D>A，即pH影响最大，其次是提取温度、提取时间，液固比影响最小，其中pH和提取温度影响显著，提取时间和液固比影响不显著。

由此确定最优组合为B2C2D2A2，
即pH为10，提取温度为60℃，提取时间为60 min，液固比为14∶ 1，在此条
件下进行3次重复验证实验，蛋白质提取率达到73.21%。

棉籽分离蛋白产品基本成分见表5。

表5 棉籽分离蛋白产品基本成分 %水分蛋白质含量(N×6.25,干基)残油率游离棉
酚NSI6.0290.760.540.03321.34
由表5可见，棉籽分离蛋白产品蛋白质含量达到90.76%(N×6.25，干基)，且游
离棉酚含量降低到0.033%。

另外，棉籽分离蛋白产品经95%乙醇洗涤后色泽呈
浅黄色， NSI为21.34%，溶解性变化不大。

2.3 棉籽分离蛋白相对分子质量分布
棉籽分离蛋白SDS-PAGE电泳谱图如图5所示。

注：1.标准蛋白；2.棉籽分离蛋白。

图5 SDS-PAGE电泳谱图
由图5可知，棉籽分离蛋白SDS-PAGE电泳谱图共有8条主要的蛋白质谱带，所对应的蛋白质亚基相对分子质量从上至下约为59.3、53.7、25.2、23.8、22.6、20.1、17.9、14.5 kDa。

其中相对分子质量为59.3 kDa和53.7 kDa的条带较粗，
颜色较深，表明该相对分子质量的蛋白质含量相对较高，达47.66%。

3 结论
由单因素实验及正交实验优化得到碱溶酸沉法制备棉籽分离蛋白的最佳工艺条件为：提取温度60℃，提取时间60 min，pH 10，液固比14∶1；在此条件下进行3次重复验证实验，蛋白质提取率达到73.21%，产品蛋白质含量达到
90.76%(N×6.25,干基)，且游离棉酚含量降低到0.033%。

另外，通过SDS-PAGE 电泳可知棉籽分离蛋白的蛋白质亚基主要有8条谱带，相对分子质量主要为59.3 kDa和53.7 kDa，占47.66%。

【相关文献】
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