胸腺肽对哮喘大鼠的调节及机制的研究

胸腺肽对哮喘大鼠的调节及机制的研究
闫超;许珂玉
【摘要】Objective To explore the regulation role and expression level of thymosin for Th1/Th2 and T-bet , GATA-3 in asthma model rats respectively.Methods 60 SPF grade male rats (6-8w) were randomly divided into six groups:control group, asthma model group, dexamethasone (0.5 mg/kg) group, thymosin high dose group (5 mg/kg), thymosin middle dose group(2.5 mg/kg), thymosin low dose group (1.25 mg/kg).The asthma model was constructed with ovalbumin.The rat in the control group and asthma model group were injected with normal saline by intraperitoneal , while other rats were injected with corresponding drugs.Then the concentration of IL-4 and IFN-γin the serum of rats were tested by the method of enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) and the protein expression level of GATA-3 and T-bet factor in the lung tissue were tested by immunohistochemistry in each group.Results The concentration of IL-4 in the serum was higher and IFN-γwas lower in the asthma model group than the other groups , while the protein expression level of GATA-3 was higher and T-bet was lower in the asthma model group than the other groups ( all P <0.05 ) . Conclusion Thymosin upregulation of IFN-γand inhibition of IL-4 may be achieved by upregulating T-bet and downregulating GATA-3, and thymosin has therapeutic effect on asthma rats.%目的：观察胸腺肽对哮喘大鼠Th1／Th2的调节作用，研究胸腺肽对T－bet和GATA－3表达的影响。

方法将60只SPF
级6～8周龄的雄性大鼠分为正常组、哮喘组、地塞米松组（0．5 mg／kg）、胸腺肽高剂量组（5 mg／kg）、胸腺肽中剂量组（2．5 mg／kg）、胸腺肽低剂量组（1．25 mg／kg）。

用卵清蛋白致敏法建立大鼠哮喘模型。

正常组及哮喘组腹腔注射生理盐水，其他组注射相应药物。

用酶联免疫吸附试验（ ELISA）法检测各组大鼠血清中IL－4、IFN－γ的含量。

免疫组化法检测各组的肺组织中GATA－3和T－bet因子蛋白表达情况。

结果哮喘组血清中IL－4含量比其他组浓度均高（ P＜0．05），哮喘组血清中IFN－γ含量比其他组浓度均低（ P＜0．05）。

哮喘组GATA－3蛋白的表达比其他组浓度均高（P＜0．05）。

各组中T－bet的表达，哮喘组Fbet的表达比其他组浓度均低（P＜0．05）。

结论胸腺肽通过上调T－bet和下调GATA－3实现上调IFN－γ和抑制IL－4的调节，对哮喘大鼠有治疗作用。

【期刊名称】《中国生化药物杂志》
【年(卷),期】2015(000)012
【总页数】4页(P32-35)
【关键词】支气管哮喘;胸腺肽;GATA-3;T-bet
【作者】闫超;许珂玉
【作者单位】辽宁医学院生物化学与分子生物学教研室，辽宁锦州 121000;辽宁医学院生物化学与分子生物学教研室，辽宁锦州 121000
【正文语种】中文
【中图分类】R562.25
支气管哮喘是一种以T淋巴细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞浸润，以气道炎症、
气道可逆性阻塞和高反应性为主要病理特征，由一系列炎性介质和细胞因子参与的变态反应性慢性疾病[1]。

近年来研究发现，Th1/Th2细胞在数量和功能方面失衡，将会导致哮喘疾病的发生，并且发现GATA-3和T-bet作为Th0的上游直接转录因子，参与并调控着它向Th1和Th2的分化[2]。

含有转录因子特征的GATA-3，只表达在Th2细胞中，促进Th2细胞因子的表达。

GATA-3含有锌指结构域，对Th0细胞分化成Th2细胞具有促进作用，并且对Th0细胞分化成Th1细胞具有抑制作用。

含有Th1细胞特异性转录因子特征的T- bet蛋白，只在Th1细胞中表达，对Th0细胞分化成Th1细胞具有促进作用，对GATA-3基因表达具有抑制作用，所以也对Th2因子的合成具有抑制的作用[3]。

所以在Th1/Th2免疫调节机制中，GATA-3和T-bet处于核心地位。

胸腺分泌的多肽混合物胸腺肽，具有生物活性，并且具有调节和增强人体免疫的作用[4]。

胸腺肽能够调节和控制T淋巴细胞的分化、成熟及其功能的表达，从而调节Thl/Th2平衡[5]。

临床上使用胸腺肽治疗哮
喘已有较显著的疗效，但是具体的治疗机制尚不明确[6]。

据此，本研究以卵清蛋
白致敏大鼠建立哮喘模型，以探讨胸腺肽治疗哮喘的分子机制，为胸腺肽治疗哮喘的机制提供实验性的理论依据。

1.1 材料
1.1.1 实验动物:60只6-8周龄SPF级健康雄性大鼠，体质量180～220 g，购于
辽宁医学院实验动物中心，饲养于辽宁医学院实验动物中心SPF级实验室，饲养
温度25 ℃，相对湿度70%，昼夜照明12 h/12 h。

1.1.2 主要试剂及仪器:鸡卵白蛋白购自美国Sigma公司，灭活百日咳杆菌菌苗，
α-SMA免疫组化试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，地塞米松注射液购自上海通用药业股份有限公司，兔抗大鼠T-bet单克隆抗体，兔抗大鼠GATA-3单克隆抗体，辣根过氧化酶(HRP)标记山羊抗兔IgG购自SantaCruz，
ELISA试剂盒购自深圳晶美生物工程进口分装产品，雾化器购自北京中西远大科技有限公司，呼吸流量换能器购自北京新航兴业科贸有限公司。

1.2 方法
1.2.1 哮喘大鼠模型的建立:按照随机数字表将60只大鼠分为6组，每组10只。

即：A组：正常组，B组：哮喘组，C组：地塞米松治疗组，D组：胸腺肽低剂量治疗组，E组：胸腺肽中剂量治疗组，F组：胸腺肽高剂量治疗组。

适应性饲养于辽宁医学院实验中心1周后，B、C、D、E、F组大鼠在第一天和第八天每只腹腔注射1 mL抗原液(含卵蛋白100 mg，灭活百日咳杆菌5×109个和氢氧化铝100 mg)致敏，两周后给予大鼠每天雾化吸入5%卵蛋白持续30分钟，连续14天；B 组在每次雾化吸入前半小时给予每只大鼠腹腔注射生理盐水1 mL；C组在每次雾化吸入前半小时予每只大鼠腹腔注射0.5 mg/kg地塞米松；D组在每次雾化吸入前半小时给予每只大鼠腹腔注射1.25 mg/kg胸腺肽；E组在每次雾化吸入前半小时给予每只大鼠腹腔注射2.5 mg/kg胸腺肽；F组在每次雾化吸入前半小时给予每只大鼠腹腔注射5 mg/kg胸腺肽。

A组为正常对照组，用生理盐水代替卵蛋白致敏和激发大鼠。

1.2.2 肺通气功能:末次给药24 h后进行指标测定，测定各组大鼠的潮气量、呼吸频率，计算每分钟通气量。

1.2.3 ELISA测量IL-4、IFN-γ的表达:末次给药24 h后取大鼠外周血2～4 mL，离心后取血清然后按照ELISA试剂盒的步骤操作，等密封装平衡至室温，从中取出所需的板条，其余密封放回4 ℃。

加样：分别将100 μL不同浓度的待测液加入相应孔中，然后用封板膜封住反应孔，空白孔除外。

温育：37 ℃共同温育30分钟，洗板4次。

，然后除空白孔外，每孔加入100 μL检测剂工作液。

封住板孔，室温(20～25 ℃)孵育60分钟后洗板4次。

显色：每孔加入一滴显色剂A和一滴显色剂B，室温避光显色20分钟。

终止：每孔加入一滴终止液混匀。

测定：以空
白孔调零，450 nm波长测量OD450值，测定应在加终止液后10分钟以内进行。

1.2.4 免疫组化法测量肺组织中GATA-3和T-bet的表达:石蜡组织切片常规脱蜡
至水，按顺序浸入100%二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各10 min，无水乙醇Ⅰ、无水乙
醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、蒸馏水中各1次，每次5 min；灭活内
源性过氧化酶：用新配置的3%H2O2，室温孵育15 min，然后双蒸水水洗3次，每次5 min；抗原修复：采用高压修复抗原方法，待修复液中的切片自然冷却至室温后，PBS洗3次，每次5 min；封闭：用10%的正常山羊血清封闭，室温孵育30 min；抗原抗体反应：滴加适当比例的一抗，4 ℃湿盒内孵育20 h，然后滴加
二抗，37 ℃条件下孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加辣根酶标记链
霉菌卵白素工作液，37 ℃条件下孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min；DAB
显色，梯度酒精、二甲苯脱水并透明，然后中性树胶封片，最后显微镜观察并拍照。

使用医学图像分析管理系统进行免疫组化的半定量，最后计算求得染色指数。

1.3 统计学方法采用SPSS20.0软件进行统计学分析，数据结果以“±s”表示，
并采用单因素方差分析进行组间比较；以P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 卵清蛋白激发后各组大鼠的体征出现动作烦躁不安、直立呼吸且呼吸比较急促，连续激发后体重减轻，经胸腺肽和地塞米松治疗后上述症状明显减轻。

2.2 肺通气功能指标哮喘模型组潮气量和肺通气量低于正常对照组，呼吸频率高
于正常对照组，差异显著(P<0.05)，说明造模成功。

哮喘组呼吸频率均高于胸腺
肽各剂量组和地塞米松组(P<0.05)。

哮喘组潮气量低于胸腺肽高、中剂量组和地
塞米松组(P<0.05)，并且胸腺肽高剂量组和地塞米松组潮气量较高。

胸腺肽高、
中剂量组和地塞米松组肺每分钟通气量与正常组接近，并且高于哮喘模型组
(P<0.05)，见表1。

2.3 血清中IL-4和IFN-γ的含量哮喘组外周血血清中IL-4的浓度明显高于正常对照组、地塞米松组和胸腺肽高、中剂量组，差异显著(P<0.05)。

正常对照组、地
塞米松组和胸腺肽高、中剂量组之间相比差异无统计学意义。

哮喘组外周血血清中IFN-γ的浓度明显低于正常对照组、地塞米松组和胸腺肽高、中剂量组，差异显著(P<0.05)。

正常对照组、地塞米松组和胸腺肽高、中剂量组之间相比差异无统计学意义，见表2。

2.4 肺组织中GATA-3和T-bet的表达免疫组化染色结果可以看出阳性结果为棕色颗粒，阴性结果为蓝色颗粒。

哮喘组与对照组比较GATA-3的表达明显增高，被染成一周的棕色颗粒，经胸腺肽和地塞米松治疗后治疗后阳性颗粒明显减少，说明GATA-3的表达降低。

哮喘组T-bet的表达明显低于对照组，经胸腺肽和地塞米松治疗后治疗后均能明显上调T-bet的表达，阳性颗粒明显增多(见图1、3)。

半定量法统计目标蛋白的表达量(染色指数)见图2和图4。

哮喘组和胸腺肽低剂量组GATA-3表达水平明显高于正常组(P<0.05)，地塞米松组和胸腺肽高、中剂量组明显低于哮喘组(P<0.05)。

各组T-bet表达水平，哮喘组和胸腺肽低剂量组明显低于正常组(P<0.05)，地塞米松组和胸腺肽高、中剂量组明显高于哮喘组
(P<0.05)。

哮喘属于Ⅰ型变态反应性疾病，在特定的细胞因子环境下，变态原经相应递呈细胞呈给CD4+细胞，CD4+细胞向Th2细胞过度增殖，而在哮喘炎症发生发展的过程中起着关键作用的是过量活化的Th2细胞[7]。

当Th2细胞大量增殖，Th1/Th2就会失衡，而哮喘发病的关键环节是Th1/Th2失衡，并且这个比例贯穿于哮喘的各个阶段[8]。

因此，药物干预治疗的首选靶点是调节Th1/Th2平衡，对治疗哮喘具有重要意义[9]。

IFN-γ是Th1细胞分泌的主要细胞因子，对哮喘具有保护作用[10]。

IL-4是Th2细胞分泌的主要细胞因子，对哮喘具有伤害作用[11]。

IFN-
γ/IL-4比例变化可以反映Th1/Th2比例变化，生理状态下二者互相制约达到动态平衡，但是一旦平衡被打破将会导致疾病的发生[12]。

本实验研究结果表明胸腺肽治疗组与哮喘组比较明显改善(P<0.05)，ELISA结果显示胸腺肽能够调节血清IL-4
与IFN-γ的比例，具有调节Th1/Th2失衡的作用。

体内外大量实验研究表明GATA-3和T-bet是控制Th1和Th2分化的关键性转录因子，在Th1/Th2的转换中起着调节作用[13]。

免疫组化结果显示，胸腺肽能胸
腺肽在抑制GATA-3的表达，上调T-bet的表达。

胸腺肽能够调节和控制T淋巴细胞的分化、成熟及其功能的表达，调节Thl/Th2
平衡[14]。

糖皮质激素被公认为最有效的消除气道炎症的药物，但糖皮质激素多用于哮喘的终末阶段、慢性气道炎症，且其全身用药副作用较大，即使是吸入激素长期使用后，亦可产生对下丘脑—垂体—肾上腺轴的抑制作用，并可以抑制生长激
素的分泌，影响儿童的生长发育[15]。

近年来，随着对哮喘发病机制和病理生理认识的不断深入，治疗的目标亦更趋于哮喘发病的起始阶段。

本实验试图探讨胸腺肽治疗机制，通过实验研究发现，经过胸腺肽治疗的哮喘，GATA-3和IL-4的表达
降低(P<0.05)，而T-bet和IFN-γ的表达增加(P<0.05)。

综上所述，胸腺肽对Th1/Th2失衡的调节作用可能通过抑制GATA-3表达的同时，进一步抑制IL-4的表达，通过上调 T-bet的表达，促进IFN-γ的表达，进而促进Th0向Th1分化，因此对Th1/Th2失衡具有调节作用。

【相关文献】
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