人乳腺癌组织活化型MMP-2的分布及意义

人乳腺癌组织活化型MMP-2的分布及意义
郭玉芳;梅红;张丽红;刘巍;郑贤红;李一雷
【摘要】目的:研究人乳腺癌组织中活化型MMP-2的分布及与乳腺癌侵袭和转移的关系.方法:采用组织酶谱分析和DQ明胶原位酶谱分析方法检测乳腺癌组织中明胶酶活性.结果:组织酶谱分析显示,乳腺癌组织中存在MMP-2和MMP-9,只有MMP-2存在活化型;DQ明胶原位酶谱分析显示,活化型MMP-2主要定位于肿瘤
细胞中;在癌组织中绿色荧光表达均为强阳性,而在肿瘤边缘癌组织中荧光表达强弱
不同,表达强度与肿瘤的分级、淋巴结转移有关.结论:人乳腺癌组织中明胶酶活性主要由MMP-2产生,活化型MMP-2主要定位于肿瘤细胞,其表达强度与肿瘤的分级、淋巴结转移有关,并在乳腺癌的侵袭和转移中发挥重要作用.
【期刊名称】《吉林大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2006(032)001
【总页数】3页(P103-105)
【关键词】乳腺肿瘤;明胶酶A;酶谱分析;肿瘤侵润;肿瘤转移
【作者】郭玉芳;梅红;张丽红;刘巍;郑贤红;李一雷
【作者单位】吉林大学基础医学院,病理生物学教育部重点实验室,吉林,长
春,130021;陕西医学高等专科学校,陕西,西安,710068;吉林大学基础医学院,病理生物学教育部重点实验室,吉林,长春,130021;吉林大学基础医学院,病理生物学教育部重点实验室,吉林,长春,130021;吉林大学基础医学院,病理生物学教育部重点实验室,吉林,长春,130021;吉林大学基础医学院病原生物学教研室,吉林,长春,130021;吉林大学基础医学院,病理生物学教育部重点实验室,吉林,长春,130021
【正文语种】中文
【中图分类】R737.9
基质金属蛋白酶-2(MMP-2)是基质金属蛋白酶家族(MMPs)中的一种，属于明胶酶类[1]，能够特异性的降解基底膜中的Ⅳ型胶原，在恶性肿瘤侵袭和转移中具有重
要的作用[2]。

MMP-2以酶原形式分泌，在细胞外被活化，只有活化型的MMP-2才能发挥其降解细胞外基质成分的作用[3]。

本研究采用组织酶谱分析和DQ明胶
原位酶谱分析[5]方法检测乳腺癌组织中活化型MMP-2的分布，并结合临床病理
参数进行分析，探讨活化型MMP-2在乳腺癌侵袭和转移中的作用。

1 材料与方法
1.1 标本来源乳腺癌标本22例，均为浸润性导管癌，正常乳腺组织3例，全部来自2003-2004年吉林大学基础医学院病理活检标本。

1.2 备样取组织50 mg匀浆，加入0.2 mL提取缓冲液(1% Triton X-100,50 mmol·L-1 Tris-HCl pH 7.6,200 mmol·L-1 NaCl, 10 mmol·L-1 CaCl2),4℃过夜，10 000 r·min-1离心10 min；取上清10 μL与上样缓冲液5 μL混合备用。

1.3 组织酶谱分析配制10%SDS-PAGE胶(含1.0 g·L-1明胶),作为分离胶,上层覆
以5%的浓缩胶,上样,30 mA恒流电流4 h,电泳后凝胶于2.5% TritonX 100中浸
泡1 h,中间换液2次，然后在50 mmol·L-1 Tris-HCl，200 mmol·L-1 NaCl,10 mmol·L-1 CaCl2,pH 7.6溶液中37℃孵育过夜,考马斯亮蓝染色,脱色液(甲醇∶乙酸∶水=3∶1∶6)脱色,观察结果。

1.4 DQ明胶原位酶谱分析新鲜乳腺癌标本，6 μm厚冰冻切片，空气干燥30 min，在切片上加入含50 μmg·L-1的DQ明胶(明胶带有FITC标记，当明胶被降解时发出绿色荧光)，4℃孵育过夜，甘油封片，荧光显微镜下观察。

观察后再将该
切片做HE染色，用图像分析仪扫描同一部位。

荧光的强弱通过明胶酶分析试剂盒中提供的胶原酶来作对比，分别用0.02和2 U·mL-1的胶原酶及1×反应缓冲液与50 mg·L-1的DQ明胶混合，2 h后，在荧光显微镜下观察到不同的荧光强度。

以此为标准，加入1×反应缓冲液不出现绿色荧光作为-；加入0.02 U·mL-1胶原酶的不完全降解DQ明胶出现较弱的荧光为+；加入2.00 U·mL-1胶原酶的完全降解DQ明胶出现较强的荧光为。

1.5 统计学分析所有结果经SPSS1
2.0统计软件处理。

构成比比较采用χ2检验。

2 结果
组织酶谱分析结果显示，从上至下的条带为相对分子质量92 000的MMP-9的酶原形式、72 000的MMP-2的酶原形式、62 000的 MMP-2的活性形式，表明乳腺癌组织中存在明胶酶，包括MMP-9和MMP-2，其中MMP-2存在活性形式，说明乳腺癌组织中明胶酶活性主要由MMP-2产生，见图1。

Fig.1 Tissue zymography detection of MMP-2 and MMP-9Lane 1:Normal tissue;Lane 2-5:Breast cancer tissue
DQ明胶原位酶谱分析可以在组织原位对MMP-2的活性进行分析。

MMP-2的活性通过产生绿色荧光的强度来判定，分为-、+、 3个级别。

结果显示，绿色荧光出现在肿瘤细胞，在乳腺癌组织中、癌巢部位均有较强的绿色荧光出现，在肿瘤边缘癌组织中，也有绿色荧光的表达，但是荧光表达的强弱不同(图2，见封三)。

22例乳腺标本中，乳腺癌组织荧光表达均为(占总例数100%)，边缘癌组织中荧光表达者12例(占总例数55%)，+者10例，乳腺癌组织和边缘癌组织者所占构比比较差异有显著性，(P<0.05)。

在3例正常乳腺组织中则未出现绿色荧光，与癌组织相比差异有显著性(P<0.05)。

乳腺癌组织中，绿色荧光的表达在不同分级、分期及有无淋巴结转移间的比较差异无显著性(P>0.05);肿瘤边缘癌组织肿瘤分级，Ⅰ级7例患者，荧光表达为者1例，+者6例；Ⅱ～Ⅲ级15例患者，荧光表达为
者11例，+者4例，Ⅰ和Ⅱ级者所占构成比差异有显著性(P<0.05)。

淋巴结转移
阳性8例中，荧光表达全部为；在阴性14例患者，只有4例荧光表达为(P<0.05)。

3 讨论
组织酶谱分析结果表明，乳腺癌组织中出现了MMP-2和MMP-9两种明胶酶的
水解条带，但只有MMP-2出现了其活化形式的水解条带，因此认为明胶酶活性
主要是由MMP-2产生的。

进一步采用DQ明胶原位酶谱分析方法对其活性形式
的分布进行分析，结果显示在乳腺癌组织中均有较强的绿色荧光出现，而在肿瘤边缘癌组织中荧光表达的强弱不同，在不同乳腺癌分级、有无淋巴结转移中表达强度不同，在乳腺癌组织和边缘癌组织中荧光表达的强弱差异也有显著性，说明活化型的MMP-2表达与肿瘤的恶性生物学行为有关，并随着肿瘤过程的发展而增强，
进一步明确活化型MMP-2在肿瘤演进过程中的重要作用。

本实验结果显示，活
化型MMP-2定位于肿瘤细胞中，尽管文献上报道[6]MMP-2存在于肿瘤细胞和
基质中，认为不仅肿瘤细胞能分泌MMP-2，间质细胞也可以分泌MMP-2，但不论是何种细胞分泌的MMP-2，肿瘤细胞可以导致其活化，正是这种活化在乳腺癌的侵袭和转移中发挥了重要作用。

因此，活化型MMP-2在乳腺癌的发展过程中
具有重要的作用。

[参考文献]
【相关文献】
[1]Kleiner DE, Stetler-Stevenson WG. Matrix metalloproteinases and metastasis[J]. Cancer Chemother Pharmacol, 1999, 43:S42-S51.
[2]Chambers AF, Matrisian LM. Changing views of the role of matrix metalloproteinases in metastasis [J]. J Natl Cancer Inst, 1997, 89:1260-1270.
[3]Kaori K, Taketoshi S, Takashi S,et al. Activation of pro-MMP-2 mediated by MT1-MMP
in human salivary gland carcinomas: possible regulation of pro-MMP-2 activation by TIMP-2[J]. J Pathol, 2004, 202:403-411.
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[6]La Rocca G, Pucci Minafra I, Marrazzo A, et al. Zymographic detection and clinical correlations of MMP-2 and MMP-9 in breastcancer sera [J] . Br J Cancer, 2004,90
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