临床样本PBMC多肽预孵育ELISPOT实验

Elispot检测报告
1.实验目的
Elispot技术检测临床样本PBMC在多肽刺激下IFN-γ的分泌情况。

2.实验材料
Human IFN-γ precoated ELISPOT kit购自达科为公司；
CEF Peptide Pool购自MebTech公司；
RPMI 1640培养基购自赛默飞世尔公司；
Fetal Bovine Serum胎牛血清购自赛默飞世尔公司；
penicillin streptomycin、L-Glutamine、MEM non-essential amino acids、sodium pyruvate、HEPES buffer均购自赛默飞世尔公司；
多肽由南京金斯瑞公司、南京肽业公司合成；
4111型二氧化碳培养箱购自赛默飞世尔公司；
IC1000细胞计数仪购自Counterstar公司；
1384型生物安全柜购自赛默飞世尔公司；
ST16型离心机购自赛默飞世尔公司；
相关耗材(Tip头、EP管等)购自Axygen公司，均为无RNase、DNase和无热源的分子生物学耗材。

3.实验方法
3.1 PBMC的分离、复苏培养和多肽预孵育
1)取血样5 ml收集于15ml离心管，800×g离心10 min，取上清血浆，56 ℃水
浴30 min，4 ℃冷却30 min，1500×g 离心10 min，取离心后的上清作为自体血清；沉淀（细胞）用PBS重悬至10 ml，取15 ml离心管，先加入5 ml 预温的ficoll液，缓慢加入10 ml重悬血样(分离液、抗凝未经稀释全血、PBS 体积为1:1:1)，700×g离心20 min，转速慢升慢降。

2)小心吸取白膜层到另一离心管中。

用PBS 或RPMI1640 稀释到一定体积，
颠倒混匀。

室温，300×g离心10 min，弃上清。

重复洗涤1-2 次。

3)从液氮中取出冻存的细胞，立即放入37℃水浴中，待全部融化后，用10ml
预热的完全培养基混合均匀，300×g离心10 min。

4)沉淀用一定体积的RPMI1640+10%FBS+1×P.S.+1×MEM non-essential
amino acids+1 mM sodium pyruvate+10 mM HEPES buffer 重悬，使其活细胞密度达到2×106/ml。

用台盼蓝染色计数测活率。

5)将细胞置于24孔板中，使其细胞密度达到1-3×10^6/ml，并加入配制好的
多肽pool预孵育24h，之后将细胞洗涤2次，转移至ELISPOT板，持续加入多肽刺激后检测IFN-γ；
3.2Elispot抗体包被
1)使用预包被抗体试剂盒，按实验需求取出相应的板条数量。

2)每孔加入200 μL RPMI-1640 培养基或者无血清培养基，室温静置5-10 分钟
后将其扣出。

3)预包被板活化后即可加入细胞。

3.3 Elispot 细胞上板
1)将预孵育好的PBMC加入Elispot板中，每孔加入100 μl。

未加多肽的组别
均加入与多肽组相同的DMSO浓度作为对照，各组DMSO浓度均<0.1%。

具体实验分组按下表操作：
郑寒珂180813治疗后：
多肽预孵育24h：共14条多肽，配制成一个多肽pool，5 μg/ml/多肽
细胞上板培养22h：多肽共分5个pool，每个实验孔5 μg/ml/多肽，增加一组上板不加多肽。

2)放入37℃培养箱中培养。

3.4 Elispot显色
1)倾倒孔内细胞及培养基。

加冰冷的去离子水，200μL/well，4℃冰箱放置10
分钟低渗裂解细胞。

2)每孔加入100 μl生物素标记的检测抗体，37 ℃孵育1 h。

3)弃去液体，用Wash buffer漂洗5次，扣干，每孔加入100 μl稀释好的链霉
亲和素，37 ℃孵育1 h。

4)弃去液体，用Wash buffer漂洗5次，扣干，每孔加入100 μl新鲜配制的AEC
显色液，室温避光静置30 min。

5)要终止反应，弃去孔内液体并用去离子水洗涤PVDF膜的正反两面，室温避
光晾干。

6)观察斑点结果。

4.实验结果
本次实验以斑点数量表示PBMC中T细胞分泌IFN-γ的活性强弱，斑点数量与分泌活性强弱呈正相关。

多肽信息
郑寒珂：共14条，ZHK01、04、05、07、08、09、10、11、12、14、15、16、17、19
使用含10%DMSO的PBS溶解多肽，多肽初始浓度均为10 μg/μl。

再根据需求分组并用PBS稀释多肽，多肽工作液浓度为500 μg/ml/多肽。

各组斑点图片结果：
郑寒珂180813治疗后：
斑点数：415斑点数：0
斑点数：1斑点数：0
斑点数：0斑点数：0
从斑点结果上看，各实验组与阴性对照组比较，各实验组均表现为阴性。