PRRSV诱导炎症反应及其调控机制
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I
华中农业大学 2013 届博士学位论文
3.2.9 双荧光素酶检测实验 ................................................................................................. 29 3.2.10 PRRSV 的间接免疫荧光（IFA）验证 .................................................................... 29 3.2.11 DAPI 染色.................................................................................................................. 29 3.2.12 激光共聚焦显微镜观察 ........................................................................................... 30 3.2.13 统计学方法 ............................................................................................................... 30 第 4 章 结果与分析........................................................................................................................... 31 4.1 高致病性 PRRSV 感染激活 IL-1β的分子机制及其生物学意义研究 ............................... 31 4.1.1 PRRSV 在 PAM 细胞中的感染动力学分析 .............................................................. 31 4.1.2 PRRSV 感染显著激活 IL-1β ...................................................................................... 32 4.1.3 PRRSV 感染激活 IL-1β上游信号通路的研究 .......................................................... 33 4.1.4 NLRP3 炎症小体参与 PRRSV 感染诱导 IL-1β的成熟与分泌 ................................ 42 4.1.5 ROS 和 K+外流参与 PRRSV 感染诱导 IL-1β的成熟与分泌 ................................... 44 4.1.6 TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路参与 PRRSV 诱导 NLRP3 炎症小体各元件的表达 ............................................................................................................................................... 46 4.1.7 PRRSV 诱导 IL-1β的生物学意义 .............................................................................. 47 4.2 PRRSV 激活 IL-6 的分子机制研究 ...................................................................................... 49 4.2.1 PRRSV 感染显著激活 IL-6 ........................................................................................ 49 4.2.2 PRRSV 感染激活 IL-6 上游信号通路的研究 ........................................................... 50 4.2.3 NLRP3 炎症小体参与 PRRSV 感染诱导 IL-6 的成熟与分泌 ................................. 53 4.2.4 ROS 和 K+外流参与 PRRSV 感染诱导 IL-6 的分泌 ................................................ 55 4.2.5 猪源 IL-6 蛋白不影响 PRRSV 在 PAM 细胞中的增殖 ............................................ 56 4.3 PRRSV 激活 IL-8 的分子机制研究 ...................................................................................... 56 4.3.1 PRRSV 感染显著激活 IL-8 ........................................................................................ 56 4.3.2 PRRSV 感染激活 IL-8 上游信号通路的研究 ........................................................... 57 4.3.3 NLRP3 炎症小体参与 PRRSV 感染诱导 IL-8 的成熟与分泌 ................................. 61 4.3.4 ROS 和 K+外流参与 PRRSV 感染诱导 IL-8 的分泌 ................................................ 62 4.3.5 猪源 IL-8 蛋白不影响 PRRSV 在 PAM 细胞中的增殖 ............................................ 63 第 5 章 讨论与结论........................................................................................................................... 65 5.1 讨论........................................................................................................................................ 65 5.1.1 PRRSV 激活 IL-1β 的分子机制及其生物学意义研究 ............................................. 65 5.1.2 PRRSV ....................................................... 68 5.2 结论........................................................................................................................................ 70 参 考 文 献......................................................................................................................................... 71 致 谢................................................................................................................................................. 82 附 录................................................................................................................................................... 83
1.1 炎症反应 ................................................................................................................................... 9 1.1.1 炎症反应机制 ............................................................................................................... 9 1.1.2 炎症小体 ....................................................................................................................... 9 1.1.3 NLRP3 炎症小体 ......................................................................................................... 11 1.1.4 炎症反应的重要核心—IL-1β .................................................................................... 11 1.1.5 IL-6 ............................................................................................................................... 12 1.1.6 IL-8 ............................................................................................................................... 13 1.1.7 Toll 样受体与炎症反应 ............................................................................................... 13 1.1.8 TLR4 与炎症反应 ........................................................................................................ 15 1.1.9 RIG-I 样受体与炎症反应 ............................................................................................ 15 1.1.10 ROS 与炎症反应........................................................................................................ 15 1.1.11 K+外流（K+ efflux）与炎症反应 ............................................................................. 16
第 2 章 研究目的与意义 ................................................................................................................... 20 第 3 章 材料与方法 ........................................................................................................................... 21
1.2 PRRSV 与炎症反应................................................................................................................ 16 1.2.1 PRRSV.......................................................................................................................... 16 1.2.2 PRRSV 诱导的炎症反应............................................................................................. 17 1.2.3 PRRSV 编码的蛋白诱导的炎症反应 ......................................................................... 18 1.2.4 PRRSV 诱导炎症反应的分子机制 ............................................................................. 19
PRRSV 诱导炎症反应及其调控机制
目录
摘 要 ..................................................................................................................................................... 1 Abstract.................................................................................................................................................... 3 缩略语表（Abbreviation） .................................................................................................................... 6 第 1 章 文献综述 ................................................................................................................................. 9
3.2 试验方法 ................................................................................................................................ 25 3.2.1 PRRSV 的增殖............................................................................................................. 25 3.2.2 病毒滴度的测定 ......................................................................................................... 25 3.2.3 RNA 的提取及 RT-PCR 扩增目的片段...................................................................... 25 3.2.4 siRNA 转染（脂质体介导转染法）........................................................................... 26 3.2.5 Western Blot 检测目的蛋白在真核细胞中的表达 ..................................................... 27 3.2.6 SYBR GreenⅠ实时定量 PCR..................................................................................... 28 3.2.7 相对 mRNA 表达水平的计算 ................................................................................... 28 3.2.8 ELISA 检测细胞因子表达量 ...................................................................................... 29
华中农业大学 2013 届博士学位论文
3.2.9 双荧光素酶检测实验 ................................................................................................. 29 3.2.10 PRRSV 的间接免疫荧光（IFA）验证 .................................................................... 29 3.2.11 DAPI 染色.................................................................................................................. 29 3.2.12 激光共聚焦显微镜观察 ........................................................................................... 30 3.2.13 统计学方法 ............................................................................................................... 30 第 4 章 结果与分析........................................................................................................................... 31 4.1 高致病性 PRRSV 感染激活 IL-1β的分子机制及其生物学意义研究 ............................... 31 4.1.1 PRRSV 在 PAM 细胞中的感染动力学分析 .............................................................. 31 4.1.2 PRRSV 感染显著激活 IL-1β ...................................................................................... 32 4.1.3 PRRSV 感染激活 IL-1β上游信号通路的研究 .......................................................... 33 4.1.4 NLRP3 炎症小体参与 PRRSV 感染诱导 IL-1β的成熟与分泌 ................................ 42 4.1.5 ROS 和 K+外流参与 PRRSV 感染诱导 IL-1β的成熟与分泌 ................................... 44 4.1.6 TLR4/MyD88/NF-κB 信号通路参与 PRRSV 诱导 NLRP3 炎症小体各元件的表达 ............................................................................................................................................... 46 4.1.7 PRRSV 诱导 IL-1β的生物学意义 .............................................................................. 47 4.2 PRRSV 激活 IL-6 的分子机制研究 ...................................................................................... 49 4.2.1 PRRSV 感染显著激活 IL-6 ........................................................................................ 49 4.2.2 PRRSV 感染激活 IL-6 上游信号通路的研究 ........................................................... 50 4.2.3 NLRP3 炎症小体参与 PRRSV 感染诱导 IL-6 的成熟与分泌 ................................. 53 4.2.4 ROS 和 K+外流参与 PRRSV 感染诱导 IL-6 的分泌 ................................................ 55 4.2.5 猪源 IL-6 蛋白不影响 PRRSV 在 PAM 细胞中的增殖 ............................................ 56 4.3 PRRSV 激活 IL-8 的分子机制研究 ...................................................................................... 56 4.3.1 PRRSV 感染显著激活 IL-8 ........................................................................................ 56 4.3.2 PRRSV 感染激活 IL-8 上游信号通路的研究 ........................................................... 57 4.3.3 NLRP3 炎症小体参与 PRRSV 感染诱导 IL-8 的成熟与分泌 ................................. 61 4.3.4 ROS 和 K+外流参与 PRRSV 感染诱导 IL-8 的分泌 ................................................ 62 4.3.5 猪源 IL-8 蛋白不影响 PRRSV 在 PAM 细胞中的增殖 ............................................ 63 第 5 章 讨论与结论........................................................................................................................... 65 5.1 讨论........................................................................................................................................ 65 5.1.1 PRRSV 激活 IL-1β 的分子机制及其生物学意义研究 ............................................. 65 5.1.2 PRRSV ....................................................... 68 5.2 结论........................................................................................................................................ 70 参 考 文 献......................................................................................................................................... 71 致 谢................................................................................................................................................. 82 附 录................................................................................................................................................... 83
1.1 炎症反应 ................................................................................................................................... 9 1.1.1 炎症反应机制 ............................................................................................................... 9 1.1.2 炎症小体 ....................................................................................................................... 9 1.1.3 NLRP3 炎症小体 ......................................................................................................... 11 1.1.4 炎症反应的重要核心—IL-1β .................................................................................... 11 1.1.5 IL-6 ............................................................................................................................... 12 1.1.6 IL-8 ............................................................................................................................... 13 1.1.7 Toll 样受体与炎症反应 ............................................................................................... 13 1.1.8 TLR4 与炎症反应 ........................................................................................................ 15 1.1.9 RIG-I 样受体与炎症反应 ............................................................................................ 15 1.1.10 ROS 与炎症反应........................................................................................................ 15 1.1.11 K+外流（K+ efflux）与炎症反应 ............................................................................. 16
第 2 章 研究目的与意义 ................................................................................................................... 20 第 3 章 材料与方法 ........................................................................................................................... 21
1.2 PRRSV 与炎症反应................................................................................................................ 16 1.2.1 PRRSV.......................................................................................................................... 16 1.2.2 PRRSV 诱导的炎症反应............................................................................................. 17 1.2.3 PRRSV 编码的蛋白诱导的炎症反应 ......................................................................... 18 1.2.4 PRRSV 诱导炎症反应的分子机制 ............................................................................. 19
PRRSV 诱导炎症反应及其调控机制
目录
摘 要 ..................................................................................................................................................... 1 Abstract.................................................................................................................................................... 3 缩略语表（Abbreviation） .................................................................................................................... 6 第 1 章 文献综述 ................................................................................................................................. 9
3.2 试验方法 ................................................................................................................................ 25 3.2.1 PRRSV 的增殖............................................................................................................. 25 3.2.2 病毒滴度的测定 ......................................................................................................... 25 3.2.3 RNA 的提取及 RT-PCR 扩增目的片段...................................................................... 25 3.2.4 siRNA 转染（脂质体介导转染法）........................................................................... 26 3.2.5 Western Blot 检测目的蛋白在真核细胞中的表达 ..................................................... 27 3.2.6 SYBR GreenⅠ实时定量 PCR..................................................................................... 28 3.2.7 相对 mRNA 表达水平的计算 ................................................................................... 28 3.2.8 ELISA 检测细胞因子表达量 ...................................................................................... 29