聚合酶链式反应分子生物学PPT课件
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聚合酶链反应中的变性、退火、 延伸的温度和时间，以及循环次数， 是由具有程控的快速升温和快速降 温装置的PCR仪控制。
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第18页/共108页
第19页/共108页
PCR仪
越快，越精确，越昂贵
第20页/共108页
•
ABI 7500实时荧光定量PCR仪
普通梯度PCR仪
第21页/共108页
第15页/共108页
PCR
DNA复制
部位： DNA体外合成放大过程 成
生物体内DNA合
引物： 引物
DNA引物
RNA
（作为新链的一部分） 除）
（复制终止时被切
催化酶：TaqDNA聚合酶
DNA聚合酶
有5’→ 3’核酸外切酶 核酸外切酶
有5’ →3’
无3’ →5’核酸外切酶
第16页/共108页
有3’
PCR仪
第22页/共108页
二、PCR技术的特点
1. 高度的敏感性：可将极微量 (pg)DNA，扩增到紫外光可见的水平 (ug)，这是最主要的特点，它可对单 拷贝基因、单个细胞、单根头发、一 滴血等微量标本进行分析。
第23页/共108页
2. 高度的特异性：PCR扩增的特异性 由两个引物的序列决定，因此引物设 计至关重要。
• 1983年美国Mullis等人发明了聚合酶链反应方法；
• 1985年美国PE-Cetus公司开发出了具有应用价值 的PCR技术；
• 1987年引入了耐高温的DNA聚合酶，从而使PCR 成为一项成熟的技术，而迅速在世界各地推广。
• 1993年Mullis也因此第获5页/得共10了8页诺贝尔化学奖。
第7页/共108页
细胞内复制的过程
1）细胞内有关蛋白质参与下，DNA双螺旋解链成两条单链，各自作为模板。 2）引物酶以两条单链为模板各自合成一段引物，引物提供3’-OH末端。 3）DNA聚合酶以亲代DNA单链为模板，以dNTP为原料，按照碱基配对的原则，从
引物的3’端，循5’→3’方向，将脱氧核苷酸聚合，最终形成子代的DNA 双链。
第30页/共108页
5. 模板量要合适，一般为102~105拷贝。
50μl PCR反应体系中模板DNA推荐使用量
人基因组DNA
0.1-1 μg
大肠杆菌基因组DNA
10-100 ng
λDNA
0.5-5 ng
质粒DNA
第31页/共108页
0.1-10 ng
（二）引 物
1. 引物的性质和作用 1）引物：2条人工合成的、能与
模板DNA互补结合的脱氧寡核 苷酸。
第32页/共108页
2）引物的序列：根据欲扩增的DNA 片段两端序列而设计的。
5’端引物：与模板链的5’端序列相同； 3’端引物：与模板链的3’端序列互补。
5’
5’端引物
3’
3’ 3’
第33页/共108页
3’ 模板链
3’端引物
5’
3) 引物决定PCR扩增产物的特异性和 长度。
• 引物过短：会影响PCR的特异性； • 引物过长：需提高相应的退火温度，若
超过延伸温度即Taq DNA酶的最适温度， 则影响PCR反应产物。
第35页/共108页
2）G+C含量一般占50％～60％，有利于引物与模板的结合。G C太少扩增效果不 佳，G C过多易出现非特异条带。
3） ATCG 4 种碱基随机分布，避免连续出现3个以上相同的嘌呤或嘧啶核苷酸的成 串排列，最好随机分布。否则易使引物与模板的嘌呤或嘧啶密集区发生错配。
第8页/共108页
PCR的原理
Denaturing
95˚C
Extension 72˚C
Annealing
Tm-5˚C
第9页/共108页
PCR的基本过程
1.变性：将反应体系升温至95℃左右，样品中双链DNA解开成两条单链，各自作为 模板（待拷贝的 DNA 称为模板） 。
2 . 退 火 ： 将 温 度 降 至 引 物 的 Tm 值 以 下 ( 5 5 ℃ 左 右 ) ， 5 ’ 端 和 3 ’ 端 的 引 物 各 自 与 两 条 单链DNA模板的互补区域结合。
第38页/共108页
3.引物的使用要求
• 引物浓度要远高于模板浓度，一般每条引物的浓度0.1～ 0.5 µmol，以最低引物 量产生所需要的结果为好。引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可 5 ℃，一般在 55 ℃ 左右。
第39页/共108页
聚合酶链反应
• 又称体外DNA扩增技术。是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火延伸循环操作，在体外特异地扩增所需要的DNA片段的一种技术。它能快速将皮 克(pg)水平的DNA特异地扩增100万倍左右，达到微克(g)水平。
• 优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等。
第1页/共108页
2）Taq DNA聚合酶还具有逆转录酶活性.
(四) Taq酶的最适温度
75~80℃每个酶分子可延伸约150个核苷酸/秒， 70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为22个核苷酸/ 秒。最适温度75℃左右。
Kary B Mullis
(1944-)
1983 年提出PCR方法 1993年度诺贝尔化学奖
第6页/共108页
第一节 PCR技术的原理和特点 一、PCR基本原理
• PCR是一项DNA体外合成技术，类似于生物体内的DNA复制过程。 • 依据DNA半保留复制的机理。 • PCR合成DNA比细胞内复制过程简单。
4）适当浓度的KCl能使Taq DNA聚合 酶的催化活性
提高50～60%。
第42页/共108页
(三)忠实性
1）TaqDNA聚合酶具有5′→3 ′聚合酶活性和 5′→3ˊ外切酶活性，而无3′→ 5′外切活 性，在 PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有 校正功能。Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为 2.1×10-4。
4）引物内部不能存在互补序列，以避免形成发夹结构。 5）两个引物之间不能存在互补序列，以避免形成引物二聚体。
第36页/共108页
6）引物与非特异性序列的同源性不能超过 70%或不能有连续8个碱基互补，否则导致 非特异性扩增。
7）引物3’末端碱基一定要与模板正确配对，引 物3’端最佳碱基选择是G和C。
第25页/共108页
3. 适用样品的广泛性： 对样品的要求并 不十分严格：
1)可以是DNA，也可以是RNA
2)可以是纯化的，也可以是粗制的
3)可以是新鲜组织，也可以是陈旧组 织
4)可以是细胞，也可以是体液
4. 操作简便、快速：PCR自动化，数小 时完成。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、
易推广。
第26页/共108页
三、参与PCR反应体系 的因素及其作用
PCR体系
• 模板
• 引物
• Taq DNA 聚 合 酶
• dNTP
第27页/共108页
• 缓冲液 • 反应温度 • 循环次数 • PCR仪等
（一）模板—核酸
1. 模板：指能扩增靶DNA片段的核酸 2. DNA是直接模板，RNA是间接模 板 RNA样品必须先经过逆转录
在分子生物学、基因工程研究，以及遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究 中得到广泛应用。
并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，便于对目的基因进 行分析、鉴定。
第2页/共108页
目的基因 载体
复制子
扩增 宿主细胞
扩增
提取DNA分子
第3页/共108页
通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;要经过DNA内切、 连接、转化和培养等相关的过程，操作复杂,一般需要数周时间。
8）引物的5’端可以修饰，如：引入酶切位点、 启动子序列、用荧光素、生物素等标记等
9）引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定 条件下可扩增长至10kb的片段。
第37页/共108页
3’
G
5’
5’
C 3’
限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记
引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
• ①引物与模板DNA特异正确的结合； ②遵循碱基配对原则； ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； ④靶基因的特异性与保守性。
第24页/共108页
引物
基因
引物
组
引物的序列及其与模板结合的特异性是决 定PCR反应结果的关键。
引物设计的原则是最大限度地提高扩增效 率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。
• 一般进行30个左右的循环，特定区域 的DNA量可至少增加 106 倍。
第14页/共108页
PCR产物的积累规律
• PCR反应初期，目的DNA片段的增加呈 指数扩增。随着目的DNA扩增产物的逐 渐积累，酶的催化反应趋于饱和，此时 DNA扩增产物的增幅减慢，即出现“平 台效应”。 • 到达平台期所需要的循环次数一般在30 次循环之后。
生成cDNA， cDNA作为PCR扩增 的模板。这个技术称为逆转录 PCR（RT-PCR）。
第28页/共108页
3. 常见的扩增对象(含核酸的标本)：
• 病原体标本：有病毒、细菌、真菌、螺 旋体、立克次体、支原体等。
• 病理生理标本：有细胞、血液、绒毛、 羊水细胞、尿液、上皮细胞、体外培养 细胞系。
5’
5’端引物
3’
3’ 3’
第10页/共108页
3’ 编码链
3’端引物
5’
3. 延伸：将温度升到75℃左右，耐热的Taq DNA聚合酶催化四种 dNTP，从 引物3’-OH端开始，依据模板碱基序列互补方式依次聚合，合成一条互补 的DNA链。
DNA聚合酶
5’
3’
5’
5’
3’
5’
第11页/共108页
5 5
第4页/共108页
PCR技术的发现
• 70年代的初期由Dr. H. Klenow发现了较具有实验 价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli ；
• 1976年从 温泉中的细菌（Thermus aquaticus） 分离出来的Taq polymerase ，它的特性能耐高温。 80年代之后它被广泛运用；
（三）Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶是从一种水生栖嗜热菌YT1株 (一种嗜热真菌)分离提取出来，该酶基因全长 2.49kb，编码832个氨基酸。该酶虽然在90℃以 上几乎无DNA合成， 但确有良好的热稳定性。 （天然酶）
另一类通过基因工程合成的酶。（基因工程酶） Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反 应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应
5 5
Cycle 3
5
5
5
5
5
5
5
5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
第12页/共108页
琼脂糖凝胶电泳
PCR产物的鉴定、提取
第13页/共108页
PCR的扩增效应
• 理论上，每增加1个循环，双链DNA片 段会增加1倍，使DNA量可成指数(2n) 增加。
• 实际上，扩增效应低于指数增加，约为 (1+X)n。
第40页/共108页
(一)酶活性与热稳定性
1）酶蛋白分子量 94KDa，比活性200 000∪/mg， Taq酶的浓度通常为1~2.5∪/l，太多浪费并易 导致非特异性扩增。
2）热稳定性好：能耐受DNA变性时的高温
在92.5℃、95℃ 、97.5℃时，PCR混合物中 的Taq DNA聚合酶分别经130min、40min、 5min后，仍可保持50%的活性。
• 法医学标本：有血斑、精斑、毛发等。 • 考古标本：残留有核酸物质
第29页/共108页
4.避免有影响扩增反应的物质存在 如：核酸酶：降解DNA、RAN 蛋白酶：降解Taq DNA聚合酶 血红素、抗凝剂：抑制Taq DNA聚合 酶活性
理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩 增只向反应体系中加入单一拷贝的靶序列 DNA作为模板。
PCR反应时变性温度为95℃～20sec，50个 循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性。
第41页/共108页
(二)离子依赖性
1）Taq DNA聚合酶是Mg2+ 依赖性酶，对Mg2+ 浓 度非常敏感。
2）Mg2+浓度2.0mmol/L时，能最大限度地激活 TaqDNA聚合酶的活性。
3）Mg2+ 能与dNTP结合而降低PCR反应液中游离 的Mg2+ 浓度，优化浓度一般反应 中Mg2+ 浓度至 少应比dNTP总浓度高0.5～1.0 mmol/L。
特异性：引物只针对DNA的一个特定序列 互补结合，因此2条引物与DNA模板 特异性结合决定了要扩增的DNA区 域。
长度：2条引物分别互补于所要扩增DNA 片段的两端，使DNA片段的扩增只 限于引物之间的部位。
4) 引物设计决定PCR反应的成败。
第34页/共108页
2. 引物设计的基本要求
1）引物长度要合适，一般为16～30 个核苷酸，常用20bp左右。
第17页/共108页
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第19页/共108页
PCR仪
越快，越精确，越昂贵
第20页/共108页
•
ABI 7500实时荧光定量PCR仪
普通梯度PCR仪
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第15页/共108页
PCR
DNA复制
部位： DNA体外合成放大过程 成
生物体内DNA合
引物： 引物
DNA引物
RNA
（作为新链的一部分） 除）
（复制终止时被切
催化酶：TaqDNA聚合酶
DNA聚合酶
有5’→ 3’核酸外切酶 核酸外切酶
有5’ →3’
无3’ →5’核酸外切酶
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有3’
PCR仪
第22页/共108页
二、PCR技术的特点
1. 高度的敏感性：可将极微量 (pg)DNA，扩增到紫外光可见的水平 (ug)，这是最主要的特点，它可对单 拷贝基因、单个细胞、单根头发、一 滴血等微量标本进行分析。
第23页/共108页
2. 高度的特异性：PCR扩增的特异性 由两个引物的序列决定，因此引物设 计至关重要。
• 1983年美国Mullis等人发明了聚合酶链反应方法；
• 1985年美国PE-Cetus公司开发出了具有应用价值 的PCR技术；
• 1987年引入了耐高温的DNA聚合酶，从而使PCR 成为一项成熟的技术，而迅速在世界各地推广。
• 1993年Mullis也因此第获5页/得共10了8页诺贝尔化学奖。
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细胞内复制的过程
1）细胞内有关蛋白质参与下，DNA双螺旋解链成两条单链，各自作为模板。 2）引物酶以两条单链为模板各自合成一段引物，引物提供3’-OH末端。 3）DNA聚合酶以亲代DNA单链为模板，以dNTP为原料，按照碱基配对的原则，从
引物的3’端，循5’→3’方向，将脱氧核苷酸聚合，最终形成子代的DNA 双链。
第30页/共108页
5. 模板量要合适，一般为102~105拷贝。
50μl PCR反应体系中模板DNA推荐使用量
人基因组DNA
0.1-1 μg
大肠杆菌基因组DNA
10-100 ng
λDNA
0.5-5 ng
质粒DNA
第31页/共108页
0.1-10 ng
（二）引 物
1. 引物的性质和作用 1）引物：2条人工合成的、能与
模板DNA互补结合的脱氧寡核 苷酸。
第32页/共108页
2）引物的序列：根据欲扩增的DNA 片段两端序列而设计的。
5’端引物：与模板链的5’端序列相同； 3’端引物：与模板链的3’端序列互补。
5’
5’端引物
3’
3’ 3’
第33页/共108页
3’ 模板链
3’端引物
5’
3) 引物决定PCR扩增产物的特异性和 长度。
• 引物过短：会影响PCR的特异性； • 引物过长：需提高相应的退火温度，若
超过延伸温度即Taq DNA酶的最适温度， 则影响PCR反应产物。
第35页/共108页
2）G+C含量一般占50％～60％，有利于引物与模板的结合。G C太少扩增效果不 佳，G C过多易出现非特异条带。
3） ATCG 4 种碱基随机分布，避免连续出现3个以上相同的嘌呤或嘧啶核苷酸的成 串排列，最好随机分布。否则易使引物与模板的嘌呤或嘧啶密集区发生错配。
第8页/共108页
PCR的原理
Denaturing
95˚C
Extension 72˚C
Annealing
Tm-5˚C
第9页/共108页
PCR的基本过程
1.变性：将反应体系升温至95℃左右，样品中双链DNA解开成两条单链，各自作为 模板（待拷贝的 DNA 称为模板） 。
2 . 退 火 ： 将 温 度 降 至 引 物 的 Tm 值 以 下 ( 5 5 ℃ 左 右 ) ， 5 ’ 端 和 3 ’ 端 的 引 物 各 自 与 两 条 单链DNA模板的互补区域结合。
第38页/共108页
3.引物的使用要求
• 引物浓度要远高于模板浓度，一般每条引物的浓度0.1～ 0.5 µmol，以最低引物 量产生所需要的结果为好。引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可 5 ℃，一般在 55 ℃ 左右。
第39页/共108页
聚合酶链反应
• 又称体外DNA扩增技术。是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用，通过变性-退火延伸循环操作，在体外特异地扩增所需要的DNA片段的一种技术。它能快速将皮 克(pg)水平的DNA特异地扩增100万倍左右，达到微克(g)水平。
• 优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等。
第1页/共108页
2）Taq DNA聚合酶还具有逆转录酶活性.
(四) Taq酶的最适温度
75~80℃每个酶分子可延伸约150个核苷酸/秒， 70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为22个核苷酸/ 秒。最适温度75℃左右。
Kary B Mullis
(1944-)
1983 年提出PCR方法 1993年度诺贝尔化学奖
第6页/共108页
第一节 PCR技术的原理和特点 一、PCR基本原理
• PCR是一项DNA体外合成技术，类似于生物体内的DNA复制过程。 • 依据DNA半保留复制的机理。 • PCR合成DNA比细胞内复制过程简单。
4）适当浓度的KCl能使Taq DNA聚合 酶的催化活性
提高50～60%。
第42页/共108页
(三)忠实性
1）TaqDNA聚合酶具有5′→3 ′聚合酶活性和 5′→3ˊ外切酶活性，而无3′→ 5′外切活 性，在 PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有 校正功能。Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为 2.1×10-4。
4）引物内部不能存在互补序列，以避免形成发夹结构。 5）两个引物之间不能存在互补序列，以避免形成引物二聚体。
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6）引物与非特异性序列的同源性不能超过 70%或不能有连续8个碱基互补，否则导致 非特异性扩增。
7）引物3’末端碱基一定要与模板正确配对，引 物3’端最佳碱基选择是G和C。
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3. 适用样品的广泛性： 对样品的要求并 不十分严格：
1)可以是DNA，也可以是RNA
2)可以是纯化的，也可以是粗制的
3)可以是新鲜组织，也可以是陈旧组 织
4)可以是细胞，也可以是体液
4. 操作简便、快速：PCR自动化，数小 时完成。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、
易推广。
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三、参与PCR反应体系 的因素及其作用
PCR体系
• 模板
• 引物
• Taq DNA 聚 合 酶
• dNTP
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• 缓冲液 • 反应温度 • 循环次数 • PCR仪等
（一）模板—核酸
1. 模板：指能扩增靶DNA片段的核酸 2. DNA是直接模板，RNA是间接模 板 RNA样品必须先经过逆转录
在分子生物学、基因工程研究，以及遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究 中得到广泛应用。
并已普及到许多普通实验室，大大简化了传统的分子克隆技术，便于对目的基因进 行分析、鉴定。
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目的基因 载体
复制子
扩增 宿主细胞
扩增
提取DNA分子
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通常的DNA 扩增法是分子克隆法, 首先要构建含有目的的基因的载体, 然后将它导入细胞后进行扩增,还要用同位索探针进行筛选;要经过DNA内切、 连接、转化和培养等相关的过程，操作复杂,一般需要数周时间。
8）引物的5’端可以修饰，如：引入酶切位点、 启动子序列、用荧光素、生物素等标记等
9）引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定 条件下可扩增长至10kb的片段。
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3’
G
5’
5’
C 3’
限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变 探针标记
引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
• ①引物与模板DNA特异正确的结合； ②遵循碱基配对原则； ③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性； ④靶基因的特异性与保守性。
第24页/共108页
引物
基因
引物
组
引物的序列及其与模板结合的特异性是决 定PCR反应结果的关键。
引物设计的原则是最大限度地提高扩增效 率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。
• 一般进行30个左右的循环，特定区域 的DNA量可至少增加 106 倍。
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PCR产物的积累规律
• PCR反应初期，目的DNA片段的增加呈 指数扩增。随着目的DNA扩增产物的逐 渐积累，酶的催化反应趋于饱和，此时 DNA扩增产物的增幅减慢，即出现“平 台效应”。 • 到达平台期所需要的循环次数一般在30 次循环之后。
生成cDNA， cDNA作为PCR扩增 的模板。这个技术称为逆转录 PCR（RT-PCR）。
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3. 常见的扩增对象(含核酸的标本)：
• 病原体标本：有病毒、细菌、真菌、螺 旋体、立克次体、支原体等。
• 病理生理标本：有细胞、血液、绒毛、 羊水细胞、尿液、上皮细胞、体外培养 细胞系。
5’
5’端引物
3’
3’ 3’
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3’ 编码链
3’端引物
5’
3. 延伸：将温度升到75℃左右，耐热的Taq DNA聚合酶催化四种 dNTP，从 引物3’-OH端开始，依据模板碱基序列互补方式依次聚合，合成一条互补 的DNA链。
DNA聚合酶
5’
3’
5’
5’
3’
5’
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PCR技术的发现
• 70年代的初期由Dr. H. Klenow发现了较具有实验 价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli ；
• 1976年从 温泉中的细菌（Thermus aquaticus） 分离出来的Taq polymerase ，它的特性能耐高温。 80年代之后它被广泛运用；
（三）Taq DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶是从一种水生栖嗜热菌YT1株 (一种嗜热真菌)分离提取出来，该酶基因全长 2.49kb，编码832个氨基酸。该酶虽然在90℃以 上几乎无DNA合成， 但确有良好的热稳定性。 （天然酶）
另一类通过基因工程合成的酶。（基因工程酶） Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反 应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应
5 5
Cycle 3
5
5
5
5
5
5
5
5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
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琼脂糖凝胶电泳
PCR产物的鉴定、提取
第13页/共108页
PCR的扩增效应
• 理论上，每增加1个循环，双链DNA片 段会增加1倍，使DNA量可成指数(2n) 增加。
• 实际上，扩增效应低于指数增加，约为 (1+X)n。
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(一)酶活性与热稳定性
1）酶蛋白分子量 94KDa，比活性200 000∪/mg， Taq酶的浓度通常为1~2.5∪/l，太多浪费并易 导致非特异性扩增。
2）热稳定性好：能耐受DNA变性时的高温
在92.5℃、95℃ 、97.5℃时，PCR混合物中 的Taq DNA聚合酶分别经130min、40min、 5min后，仍可保持50%的活性。
• 法医学标本：有血斑、精斑、毛发等。 • 考古标本：残留有核酸物质
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4.避免有影响扩增反应的物质存在 如：核酸酶：降解DNA、RAN 蛋白酶：降解Taq DNA聚合酶 血红素、抗凝剂：抑制Taq DNA聚合 酶活性
理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩 增只向反应体系中加入单一拷贝的靶序列 DNA作为模板。
PCR反应时变性温度为95℃～20sec，50个 循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性。
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(二)离子依赖性
1）Taq DNA聚合酶是Mg2+ 依赖性酶，对Mg2+ 浓 度非常敏感。
2）Mg2+浓度2.0mmol/L时，能最大限度地激活 TaqDNA聚合酶的活性。
3）Mg2+ 能与dNTP结合而降低PCR反应液中游离 的Mg2+ 浓度，优化浓度一般反应 中Mg2+ 浓度至 少应比dNTP总浓度高0.5～1.0 mmol/L。
特异性：引物只针对DNA的一个特定序列 互补结合，因此2条引物与DNA模板 特异性结合决定了要扩增的DNA区 域。
长度：2条引物分别互补于所要扩增DNA 片段的两端，使DNA片段的扩增只 限于引物之间的部位。
4) 引物设计决定PCR反应的成败。
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2. 引物设计的基本要求
1）引物长度要合适，一般为16～30 个核苷酸，常用20bp左右。