植物透射电镜样品制备

3.3 毛竹
毛竹根、 毛竹根、茎、叶片的细胞壁坚硬密集， 叶片的细胞壁坚硬密集， 药物难以渗透，细胞腔大， 药物难以渗透，细胞腔大，样品容易吸收二 氧化碳并造成污染， 氧化碳并造成污染，在超薄切片样品制备中 属于难度很大的样品。采用常规制备方法时， 属于难度很大的样品。采用常规制备方法时， 极易出现切片颠痕、 极易出现切片颠痕、严重污染和难以观察到 细胞内部结构的现象。 细胞内部结构的现象。我们采用该方法制备 出了40多个竹叶样品， 40多个竹叶样品 出了40多个竹叶样品，取得了较为一致的理 想效果。 想效果。
ห้องสมุดไป่ตู้
图4为进行抗水实验的拟南芥大视野观察图面，可见片 为进行抗水实验的拟南芥大视野观察图面， 面平整、无污染、整体结构保存良好。 面平整、无污染、整体结构保存良好。图5、图6为叶绿体 的全貌和叶绿体组织的片层结构，可见片中信息丰富， 的全貌和叶绿体组织的片层结构，可见片中信息丰富，结 构清晰，没有污染、肿胀、开裂等不良的现象出现。 构清晰，没有污染、肿胀、开裂等不良的现象出现。
4.4
1
材料
1.1 杂种鹅掌楸花粉，南京林业大学校园内 杂种鹅掌楸花粉， 随机取样，浸入3%的戊二醛固定。 3%的戊二醛固定 随机取样，浸入3%的戊二醛固定。 拟南芥，南京农业大学提供， 1.2 拟南芥，南京农业大学提供，采摘后即 时浸入3%的戊二醛固定。 3%的戊二醛固定 时浸入3%的戊二醛固定。 毛竹，江苏大学提供， 1.3 毛竹，江苏大学提供，取样后即时浸入 3%的戊二醛固定 的戊二醛固定。 3%的戊二醛固定。
4 结果
4.1 一般情况下，植物样品用锇酸进行后固定，时 一般情况下，植物样品用锇酸进行后固定， 间延长可提高固定效果，但植物的种类较多， 间延长可提高固定效果，但植物的种类较多，性 能区别较大，在后固定时需区别对待， 能区别较大，在后固定时需区别对待，对于迅速 发黑的植物样品，用锇酸固定时不易超过2小时， 发黑的植物样品，用锇酸固定时不易超过2小时， 否则，会造成样品发脆，难以操作，甚至破坏掉 否则，会造成样品发脆，难以操作， 已保存的结构。 已保存的结构。 4.2 在812树脂渗透的过程中，采用3：1；3：2；3： 812树脂渗透的过程中，采用3 树脂渗透的过程中 梯度渗透法，主要是提高样品的渗透效果。 3梯度渗透法，主要是提高样品的渗透效果。根据 植物的细胞壁厚，结构密集， 植物的细胞壁厚，结构密集，药物渗透较慢的特 梯度渗透的时间间隔必须在2小时以上，否则， 点，梯度渗透的时间间隔必须在2小时以上，否则， 影响渗透效果。 影响渗透效果。
3 结果
3.1杂种鹅掌楸花粉 3.1杂种鹅掌楸花粉 细胞壁厚，组织坚硬，药物难以渗透， 细胞壁厚，组织坚硬，药物难以渗透，是 典型的制备难度大的透射电镜样品。 典型的制备难度大的透射电镜样品。采用常规 制备方法， 制备方法，超薄切片常会出现花粉内部结构不 清晰、切片有颠痕、污染等不良现象， 清晰、切片有颠痕、污染等不良现象，甚至无 法观察到样品的超微结构，造成前功尽弃， 法观察到样品的超微结构，造成前功尽弃，只 能从头再来，进一步延长了工作周期。 能从头再来，进一步延长了工作周期。笔者采 用延长锇酸固定时间， 用延长锇酸固定时间，减少树脂渗透浓度的新 方法制备出了50多个杂种鹅掌楸花粉样品， 方法制备出了50多个杂种鹅掌楸花粉样品，整 50多个杂种鹅掌楸花粉样品 体信息丰富，结构保存良好， 体信息丰富，结构保存良好，没有出现不良现 象。
植物透射电镜样品制备 技术探讨
徐柏森 杨静 南京林业大学电镜室
研究背景
近年来，随着林业经济的不断发展， 近年来，随着林业经济的不断发展，研究植 物资源的内容也越来越深入，利用透射电镜掌握大 物资源的内容也越来越深入， 量的植物细胞信息， 量的植物细胞信息，已经成为科学工作者保护森林 资源和人类生态环境的重要理论依据。但因植物材 资源和人类生态环境的重要理论依据。 料坚硬，难以制备出高分辨的透射电镜样品， 料坚硬，难以制备出高分辨的透射电镜样品，从而 限制了透射电镜在植物研究中的应用，同时也影响 限制了透射电镜在植物研究中的应用， 了人类对植物资源的开发和利用。为此， 了人类对植物资源的开发和利用。为此，电镜样品 的制备技术一直是电镜工作者深入研究的重要内容。 的制备技术一直是电镜工作者深入研究的重要内容。
图7为复水后的毛竹细胞结构状态，片中信息丰富，细胞 为复水后的毛竹细胞结构状态，片中信息丰富， 内含物质和结构都保存良好。 内含物质和结构都保存良好。
和图9为毛竹经过不同工艺处理后的细胞结构比较。 图8和图9为毛竹经过不同工艺处理后的细胞结构比较。图8为经过 加热处理后的细胞结构状态，可见细胞形态变化较大，呈扭曲状， 加热处理后的细胞结构状态，可见细胞形态变化较大，呈扭曲状，但 无断裂和损坏现象，内部物质尚能得到保存。切片完整， 无断裂和损坏现象，内部物质尚能得到保存。切片完整，无颤痕和污 染现象。 为联合处理后的细胞结构状态， 染现象。图9为联合处理后的细胞结构状态，图中显示的内部细胞结构 变化较小，细胞壁基本处于完好状态，个别细胞壁间出现断裂现象， 变化较小，细胞壁基本处于完好状态，个别细胞壁间出现断裂现象， 细胞内部物质保存良好，可见此工艺对毛竹的整体损伤较小。 细胞内部物质保存良好，可见此工艺对毛竹的整体损伤较小。
研究背景
超薄切片的分辨率高，信息丰富，是透射电镜样品制备方 超薄切片的分辨率高，信息丰富， 法中最优秀、最常用、最基本的常规技术， 法中最优秀、最常用、最基本的常规技术，从取材到染色有二 十几个步骤， 十几个步骤，任何环节出现问题都会影响到样品制备质量甚至 导致样品制备失败。加之，植物的细胞壁厚，结构密集， 导致样品制备失败。加之，植物的细胞壁厚，结构密集，药物 渗透较慢，其制备难度就显得更大一些。 渗透较慢，其制备难度就显得更大一些。 我们经过多次试验， 我们经过多次试验，发现采用延长锇酸固定时间和减少树 脂渗透浓度的方法可提高植物透射电镜样品的制备成功率和制 备质量，使植物的花粉、 备质量，使植物的花粉、径、叶、根等细胞结构显示得更加清 晰，整体信息提供的更加丰富。经过200多个植物透射电镜样 整体信息提供的更加丰富。经过200 200多个植物透射电镜样 品的观察，不但能准确观察到植物的超微结构形态， 品的观察，不但能准确观察到植物的超微结构形态，还缩短了 植物透射电镜样品的制备周期。本课件以杂种鹅掌楸、 植物透射电镜样品的制备周期。本课件以杂种鹅掌楸、拟南芥 和毛竹三种典型的植物材料为例。 和毛竹三种典型的植物材料为例。
2 方法
样品在3%的戊二醛中，固定2小时以上， 样品在3%的戊二醛中，固定2小时以上， 3%的戊二醛中 然后0.1mol/l磷酸缓冲液清洗2 0.1mol/l磷酸缓冲液清洗 每次10 然后0.1mol/l磷酸缓冲液清洗2次，每次10 分钟，锇酸固定5小时后，0.1mol/l磷酸缓 分钟，锇酸固定5小时后，0.1mol/l磷酸缓 冲液清洗2 每次10分钟，丙酮梯度脱水， 10分钟 冲液清洗2次，每次10分钟，丙酮梯度脱水， 纯丙酮脱水2 812树脂按 树脂按3 纯丙酮脱水2次，812树脂按3：1；3：2；3： 梯度渗透，之后打开样品瓶盖， 3梯度渗透，之后打开样品瓶盖，放置干燥 小时，再包埋，梯度聚合，切片，染色， 处8小时，再包埋，梯度聚合，切片，染色， 透射电子显微镜观察。 透射电子显微镜观察。
4.3
样品经树脂梯度渗透后，必须在干燥处放置 样品经树脂梯度渗透后， 小时以上，最好过夜，否则， 8小时以上，最好过夜，否则，在切片时会出现发 散现象。 散现象。 812树脂的渗透性能和切割性能都比较好， 812树脂的渗透性能和切割性能都比较好， 树脂的渗透性能和切割性能都比较好 是制备植物样品的良好材料，但容易受潮， 是制备植物样品的良好材料，但容易受潮，一 旦受潮发软，切片上会出现波浪型条纹， 旦受潮发软，切片上会出现波浪型条纹，轻则 影响观察效果，重则无法看到细胞结构。因此， 影响观察效果，重则无法看到细胞结构。因此， 配制812树脂、 812树脂 配制812树脂、树脂渗透和包埋等环节都要在干 燥的环境中进行。 燥的环境中进行。尤其在样品渗透时必须放置 在干燥器内或其他干燥、干净的环境中过夜， 在干燥器内或其他干燥、干净的环境中过夜， 使丙酮彻底挥发掉。否则， 使丙酮彻底挥发掉。否则，会造成超薄切片制 备失败。 备失败。
图1为发育正常的杂种鹅掌楸花粉细胞全貌，可见花粉内部 为发育正常的杂种鹅掌楸花粉细胞全貌， 细胞器结构保存良好，细胞壁结构保存完整，边缘信息丰富， 细胞器结构保存良好，细胞壁结构保存完整，边缘信息丰富， 在许多花粉中都可见到尾状突起。 在许多花粉中都可见到尾状突起。
图2为败育的杂种鹅掌楸 花粉全貌， 花粉全貌，可见花粉内部 的质体减少，线粒体变异， 的质体减少，线粒体变异， 细胞器呈退化状态， 细胞器呈退化状态，边缘 的细胞壁组织也出现了明 显的变异和加厚现象， 显的变异和加厚现象，使 药物更难渗透， 药物更难渗透，对于此类 样品若采用常规方法制备， 样品若采用常规方法制备， 则结构模糊，信息量较少， 则结构模糊，信息量较少， 往往只能看到少量的片层 结构。 结构。采用改进方法对其 进行制备时， 进行制备时，由于固定彻 渗透均匀， 底、渗透均匀，不但可以 很好的保存组织结构， 很好的保存组织结构，还 可以提供丰富的信息资料。 可以提供丰富的信息资料。
图3所示的多层结构即为药室内壁的胼胝质加厚现 象。可见新方法制备的样品能够提高植物样品的分辨 使超薄切片显示出更多的微细结构。 率，使超薄切片显示出更多的微细结构。
3.2 拟南芥
拟南芥是液泡组织较大的植物， 拟南芥是液泡组织较大的植物，在溶液中叶片 难以下沉，是较难固定的植物透射电镜样品。加之， 难以下沉，是较难固定的植物透射电镜样品。加之， 细胞壁结构坚硬，药物难以渗透， 细胞壁结构坚硬，药物难以渗透，其样品制备更加 困难。若采用常规制备方法， 困难。若采用常规制备方法，则会出现叶片内部结 构不清晰、切片有颤痕和开裂等不良现象， 构不清晰、切片有颤痕和开裂等不良现象，不能进 行大视野的结构观察和摄影。 行大视野的结构观察和摄影。笔者采用该方法制备 出了30多个此类透射电镜样品，整体信息丰富， 30多个此类透射电镜样品 出了30多个此类透射电镜样品，整体信息丰富，结 构保存良好，没有出现效果不良现象。 构保存良好，没有出现效果不良现象。
笔者采用延长锇酸固定时间减少树脂渗透浓度的新用延长锇酸固定时间减少树脂渗透浓度的新方法制备出了方法制备出了5050多个杂种鹅掌楸花粉样品整多个杂种鹅掌楸花粉样品整体信息丰富结构保存良好没有出现不良现体信息丰富结构保存良好没有出现不良现图图11为发育正常的杂种鹅掌楸花粉细胞全貌可见花粉内部为发育正常的杂种鹅掌楸花粉细胞全貌可见花粉内部细胞器结构保存良好细胞壁结构保存完整边缘信息丰富细胞器结构保存良好细胞壁结构保存完整边缘信息丰富在许多花粉中都可见到尾状突起