离心分离和沉淀分离演示文稿

概述
沉淀（定义） 是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。
沉淀具有选择性 有选择地沉淀杂质
有选择地沉淀所需成分
优点：操作简单、经济、浓缩倍数高 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高 、选择性不强
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概述
沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不 溶性杂质及细胞碎片）以后进行。
操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小 时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤 通常按三步进行：
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盐析用盐的选择
盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度
盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济
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蛋白质盐析
盐析操作
①直接加入固体(NH4)2SO4 粉末，工业上常采用这种 方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌 ，使其完全溶解和防止局部浓度过高；
H+
+_
_+
_
OH- + _ +
PH＞PI，带负电荷， 又有水膜是稳定的 亲水胶体
OH-
__ _
_
_
H+
__ _
中性盐 破坏水膜
中性盐 破坏水膜
中性盐 破坏水膜
+
+
+
中性盐中和其电荷
+
+
+ +
+ +
SO24- 等
_ __
_ 中性盐中和其电荷
_
NH4+或Na+等
___
蛋白质沉淀
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盐析机理示意图
•降低介电常数
•破坏水化膜
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常用的有机溶剂沉析剂
选择依据： 水溶性要好
介电常数要小
致变性作用要小（甲醇） 毒性要小、挥发性适中
容易获取
沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉 淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙 醇是最常用的沉淀剂
乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、 核酸、多糖等生物大分子的沉析；
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蛋白质的溶解特性
蛋白质是两性高分子电解质 在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具
有向内部折叠的趋势，一般仍有部分疏水性氨 基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性 氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。 亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构 的外表面。 蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电 区、亲水区和疏水区构成。
v 颗粒在角转子中沉降时，
先沿离心力方向撞向离心管， 然后再沿管壁滑向管底， 因此管的一侧会出现颗粒沉积。
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2）平抛式离心机
v平抛式离心机一类结构简单的实验室常用的低中速离
心机，转速一般在 3000-6000rpm。
v 转子活动管套内的离心管，静止时垂直挂在转头上， 旋转时随着转子转动，从垂直悬吊上升到水平位置（约
等电点沉淀法
操作注意事项
（1）适用于疏水性强的蛋白质 （2）中性盐浓度增大时，等电点向偏
酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。 （3）无机酸通常价格便宜，无毒 （4）蛋白质对低pH 敏感，易失活
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等电点沉淀实例
n从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原
的pI＝8.9，可先于pH 3.0左右进行等电点沉淀，除去 共存的许多酸性蛋白质(pI=3．O)。
②是加入硫酸铵饱和溶液，在实验室和小规模生产中， 或(NH4)2SO4 浓度不需太高时，可采用这种方式，它
可防止溶液局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。
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蛋白质盐析
盐析效果
阴离子： 柠檬酸＞PO43- ＞SO42- ＞ CH3COO-＞ Cl-＞ NO3 阳离子： NH4+ ＞ K+＞Na+ ＞高价阳离子 硫酸铵： （1） 价廉 ；（2） 溶解度大，稳定蛋白质 ；（3）
（3）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋白 质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥 力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之 间聚集而沉淀。
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蛋白质盐析
PH＜PI，带正电荷， 又有水膜，++
+
+
+
+
+
+
+ ++
在等电点状态的 酶蛋白，水膜未脱， 是不稳定的亲水胶体
n工业生产胰岛素(pI＝5.3)时：先调pH至8.0
除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同 时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。
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等电点沉淀法
细胞色素C洗脱液（离交）+ 硫酸胺（饱和度86%） 低温离心 上清液调 pH4.8- 5.1 产
物↓ 沉淀（杂蛋白）
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除第（3）种有机溶剂沉淀法也能适用于抗生素等小分子
外，其他各种方法只适用蛋白质等大分子。
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蛋白质盐析
蛋白质稳定因素
水化层
使蛋白质形成稳定的胶体溶液
双电层
静电排斥作用
n 因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚 度（ζ电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白 质的沉淀。
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离心分离和沉淀分离演示 文稿
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（优选）离心分离和沉淀分 离
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1 离心沉降原理
球形粒子沉降
斯托克斯(Stokes)公式：ut
d
2 s
(
s
)g
18
在离心力场中
斯托克斯(Stokes)公式：ut
d
2 s
(s
) 2
18
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1 离心沉降原理
斯托克斯(Stokes)公式：ut
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蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域
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概述
沉淀法操步骤 ：
沉 淀 剂
粒
过滤
子
收 集 沉
生
离心
淀
长
物
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概述
分类
（1）盐析法；
（2）等电点沉淀法；
沉
（3）有机溶剂沉淀法；
淀
（4）非离子型聚合物沉淀法；
法
（5）聚电解质沉淀法；
（6）高价金属离子沉淀法等。
200—800rpm）。 v颗粒在水平转子中的沉降是沿管子轴向移动。
v样品便于收集
v受振动和变速搅乱后对流现象小， v但转头结构复杂，最高转速相对要低
v容量也小一些。
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平抛式离心机转子
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2 离心沉降设备
瓶式离心机
n 也称平抛式离心机
n 结构最简单的实验室常用的 低，中速离心机，
丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不
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有机溶剂沉淀法的影响因素
温度
使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行，
pH值： pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。
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α-淀粉酶（米曲霉）菌体 + 水 过滤 水抽提清液
↓ 加乙醇（70%）搅拌 α-淀粉酶
蛋白质盐析
中性盐
蛋白质脱水
中和电荷
沉淀
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盐析法机理
（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量盐 加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水 化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至 消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。
（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域 间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越 易沉淀。
d
2 s
(s
) 2
18
Ｆ< ３０００ Ｆ＝３０００-５００００ Ｆ≥ ５００００
常速离心机 中速离心机
高速离心
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离心机的种类与用途
按速度和离心力：
1、常速离心机 最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)104g以下,用于细胞
、菌体和培养基残渣等分离；
2、高速（冷冻）离心机 1×104-2.5×104rpm，相对离心力104~105g,用于细
* pH影响
收率%
酶活
收率
酶活
* 温度影响
收率%
酶活 酶活
收率
10 20
T℃
* 适宜的温度10 ~ 20 ℃
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6.5
胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；
3、超速离心机 转速2.5-8×104rpm，相对离心力5*105g；用于DNA、RNA 蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等 。
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n 瓶式离心机
1）斜角式离心机
v 是一类结构最简单的实验室常用离心机，
v 指离心管腔与转轴成一定倾角的转子； v 角度越大，沉降越结实，分离效果越好， v 角度越小，颗粒沉降距离短，沉降速度快，但分离效果差。
n 转速一般在 30006000rpm。
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2 离心沉降设备
管式离心机
n 液-液分离；液-固分离 n 结构简单
n 转速很高
n 可连续操作（液-液）
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2 离心沉降设备
碟式离心机
n固体的沉降距离极短，分离效 果较好。 n碟片间的距离一般为 0.5~2.5mm,与被分离物料的性质 有关。
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蛋白质盐析
盐析注意事项：
(1) 稳定pH 用磷酸缓冲液
（2）硫酸铵加入后体积变大
（3）选择饱和度 （4）分步盐析 （5）初始蛋白浓度
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Cohn经验式 蛋白质溶解度与盐浓度的关系
㏒ S=β-ＫsＩ
S—蛋白质的溶解度，g/L; I－离子强度， I=1/2∑mizi2
n液-液分离；液-固分离
n连续操作
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2 离心沉降设备
多室式离心机
n 增加了沉降面积，减少了沉降距离
n 同时还有粒度筛分的作用 n 常用于抗菌素液－液萃取分离
n 间歇式生产
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3 离心沉降的计算
管式离心机
Ｒ０
管壁
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Ｒ１ z
Ｈ
r
沉淀分离
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高
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有机溶剂沉淀法机理
A 降低溶剂介电常数.
减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子 间的相互作用力，
B 破坏水化膜：
从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破 坏水化层
C 相反力：
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疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形成疏 水层
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水解变酸；（4）高pH 释氨，腐蚀；（5）残留产 品有影响。
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蛋白质盐析
影响因素
pH 变化
等电点附近有极小值
温度变化
随温度升高减小，热促失水膜
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8
lgβ S ７ ６ ５
OA-卵清蛋白
COHb-碳氧血红蛋白 OA
４
３
COHb 3 4 5 6 7８
以磷酸盐沉淀COHb和以硫酸铵 沉淀OA时，β随 pH的变化
mi—离子 i的摩尔浓度； Zi—所带电荷
β—常数，图中截距 Ks—盐析常数，图中直线斜率
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等电点沉淀法
原理：
调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了
静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀 。
适用于疏水性较强的蛋白质
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pH=pI
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有机溶剂沉淀法
概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有 机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。
优点在于：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质 等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）
沉淀不用脱盐，过滤较为容易；
缺点是1）对具有生物活性的大分子容易引起变 性失活，2）操作要求在低温下进行。3）成本